Étude de la voie HOX-Flt3 dans les leucémies de type pré-B induites par E2A-Pbx1

Abstract

Introduction: Notre laboratoire a précédemment établi que Hoxa9 accélérait l’apparition de leucémie de type B induite par E2A-PBX1. Une analyse par qRT-PCR a montré que les niveaux d’ARN de Flt3, une cible de Hoxa9, étaient 32 fois plus élevés dans les leucémies Hoxa9/E2A-PBX1 par rapport que dans les leucémies E2A-PBX1. Il est important de noter que l’expression aberrante de Flt3 est retrouvée dans les leucémies ALL de type B et les AML. De plus, l’activation constitutive de Flt3 est associée à un faible pronostic. Nous avons posé l’hypothèse que la maintenance/ré-initiation des leucémies de type pré-B induites par E2A-Pbx1 est associée à la présence du récepteur Flt3. Méthodes et Résultats: Premièrement, nous avons analysé par FACS la présence de Flt3 et mesuré l’expression de Flt3 par qRT-PCR des cellules E2A-PBX1 leucémiques pré-B. Nous avons montré que les cellules leucémiques E2A-PBX1 expriment l’ARNm du gène Flt3. Cependant, le récepteur n’était détectable à la surface cellulaire que dans des proportions variant de 0.3 à 28%. Deuxièmement, nous avons évalué le potentiel leucémique des fractions positive et négative pour Flt3. Toutes deux ont été capables de ré-initier la leucémie environ 20 jours après transplantation. Des analyses par FACS ont montré qu’une proportion de cellules leucémiques exprimaient Flt3, incluant même celles provenant de la fraction Flt3-. Troisièmement, une stratégie de perte de fonction de Flt3 par shARN a été mise en œuvre afin d’examiner le rôle de la voie de signalisation de Flt3 dans les cellules leucémiques E2A-PBX1. Pour ce faire, des cellules primaires leucémiques ont été infectées, soit par le shARN anti-Flt3 soit shARN contrôle, et transplantées dans des souris receveuses. Les cellules leucémiques contenant le shARN ont été capables de régénérer la leucémie. Cependant, une proportion des cellules exprimaient toujours Flt3, ce qui indique que l’efficacité des shARn n’était pas suffisante. Conclusion et Perspectives: Nos shARN ne sont pas suffisamment efficaces sur les cellules leucémiques choisies. De ce fait, nous proposons d’utiliser des cellules leucémiques moins agressives tout en réalisant le même set-up expérimental. Des transplantations dans des receveurs KO Flt3-/- seraient également requises afin de réellement étudier l’impact de la voie de signalisation Flt3 dans la ré-initiation leucémique.

Introduction: Previous work in the laboratory have established that Hoxa9 accelerated the onset of E2A-PBX1 induced B cell leukaemia. qRT-PCR analysis showed that RNA levels of HOXA9 target Flt3 was 32-fold increased in Hoxa9/E2A-PBX1 compared to E2A-PBX1 leukaemia. It is important to note that aberrant expression of Flt3 is found in both B-ALL and AML. Moreover, constitutive activation of Flt3 is associated with a poor prognosis. We hypothesized that the acceleration of E2A-PBX1 B-ALL by Hoxa9 is caused through increased Flt3 signalling. Methods and Results: First, to evaluate whether Flt3 signalling is functionally relevant for E2A-PBX1 induced leukaemia, Flt3 expression was analysed by FACS and qRT-PCR. So far, we showed that E2A-PBX1 B-ALL express FLT3 but the receptor was detected on a variable proportion of the cells, ranging from 0.3-28 %. Secondly, we evaluated the leukemic potential of Flt3 positive and negative fractions. Both reinitiate leukaemia around 20 days post-transplantation. Thirdly, a shRNA mediated knockdown strategy for Flt3 has been applied to test the relevance of Flt3 signalling on E2A-PBX1 leukemic cells. To test this, primary leukaemic cells were infected, either with the shRNA anti-Flt3 or the shRNA control, and transplanted into recipient mice. Unexpectedly, no difference was observed between the two groups of mice. Conclusion and Relevance: Our shFLT3 is not efficient enough on the chosen leukemic cells. Therefore, we propose to apply the same set-up to a less aggressive leukaemia. Moreover, transplanting cells in Flt3-/- KO mice is required to really assess the impact of Flt3 signalling.