Étude sur l'utilisation de liquides ioniques à base imidazolium pour l'extraction sélective de phosphopeptides

Abstract

La phosphorylation des protéines constitue l’une des plus importantes modifications post-traductionnelles (PTMs) et intervient dans de multiples processus physiologiques tels, la croissance, la différenciation cellulaire, l’apoptose, etc. En dépit de son importance, l’analyse des phosphoprotéines demeure une tâche difficile en raison de leur nature dynamique (car la phosphorylation des protéines est un processus réversible) et de leur faible abondance relative. En effet, la détermination des sites de phosphorylation est souvent difficile car les phosphopeptides sont souvent difficiles à détecter par des méthodes d’analyse chromatographique classique et par spectrométrie de masse (MS). De récentes études ont démontré que les nombreuses méthodes d’enrichissement de phosphopeptides existantes ne sont pas complètes, et que le nombre total de phosphopeptides détectés ne chevauchent pas complètement ces méthodes. C’est pour cela qu’il existe une nécessité de combler les lacunes des méthodes d’enrichissement existantes afin d’avoir des analyses phosphoprotéomiques plus complètes. Dans cette étude, nous avons utilisé les liquides ioniques (LI), plus particulièrement les sels d’imidazolium, comme une technique d’enrichissement alternative, dans le but de favoriser une extraction sélective de phosphopeptides présents en solution. Les sels d’imidazolium ont donc été utilisés en raison de leurs propriétés physico-chimiques "facilement" ajustables selon la nature des substituants sur le noyau imidazolium et la nature de l’anion. Les sels de monoimidazolium et de bis-imidazolium possédant respectivement des chaînes linéaires à 4, 12 et 16 atomes de carbone et ayant différents anions ont été synthétisés et utilisés pour effectuer des extractions liquide-liquide et solide-liquide des phosphopeptides en solution. Dans un premier temps, des extractions liquide-liquide ont été réalisées en utilisant un liquide ionique (LI) ayant une chaine linéaire de 4 atomes de carbone. Ces extractions réalisées avec le bis(trifluoromethanesulfonyl) amide de 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-NTf2) et l’hexafluorophosphate de 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-PF6) n’ont pas montré une extraction notable du PPS comparativement au PN. Dans un deuxième temps, des extractions solide-liquide ont été réalisées en fonctionnalisant des particules solides avec des sels d’imidazolium possédant des chaines linéaires de 12 ou 16 atomes de carbone. Ces extractions ont été faites en utilisant un phosphopentapeptide Ac-Ile-pTyr-Gly-Glu-Phe-NH2 (PPS) en présence de 2 analogues acides non-phosphorylés. Il a été démontré que les sels d’imidazolium à chaine C12 étaient meilleurs pour extraire le PPS que les deux autres peptides PN (Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) et PE (Ac-Glu-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) L’électrophorèse capillaire (CE) et la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) ont été utilisées pour quantifier le mélange des trois peptides avant et après extraction ; dans le but de mesurer la sélectivité et l’efficacité d’extraction de ces peptides par rapport à la composition chimique du liquide ionique utilisé.

Protein phosphorylation is one of the most important post-translational modifications because it is involved in multiple physiological processes such as growth, differentiation, apoptosis, etc. Despite its importance, the analysis of phosphoproteins remains a difficult task due to their dynamic nature (phosphorylation of proteins is a reversible process) and their low abundance. Indeed, the determination of phosphorylation sites is difficult because phosphopeptides are often difficult to detect by conventional chromatographic analysis and by mass spectrometric (MS) methods. Recent studies have shown that the existing methods of enrichment of phosphopeptides are not complete, and the total number of phosphopeptides detected does not overlap completely with those detected by these methods. The gaps in existing enrichment methods need to be filled in order to have more complete phosphoproteomic analyses. In the current study, ionic liquids (IL), specifically imidazolium salts, have been used in an alternative enrichment technique with potential for selective extraction of phosphopeptides from solution. Imidazolium salts were chosen because their physicochemical properties are readily adjustable depending on the nature of the substituent attached to the imidazolium core and the counter-anion. Monoimidazolium and bis-imidazolium salts with linear chains having respectively 4, 12, and 16 carbon atoms and with different anions were synthesized and used to carry out liquid-liquid and solid-liquid extractions of a phosphorylated peptide from a solution. At first, liquid-liquid extractions were carried out using an ionic liquid (IL) with a linear chain of 4 carbon atoms. These extractions performed with bis (trifluoromethanesulfonyl) amide 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-NTf2) and hexafluorophosphate 3-butyl-1-methylimidazolium (BMIM-PF6) did not show a considerable extraction of PPS comparatively to the PN. Secondly, solid-liquid extractions were done by first functionalizing solid-phase particles with the imidazolium salts. The extractions were carried out using the phosphopentapeptide Ac-pTyr-Ile-Gly-Glu-Phe-NH2 (PPS) and its acidic non-phosphorylated analogues. It has been shown that the C12 chain imidazolium salts were better to extract PPS than the other two peptides PN (Ac-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2) and PE (Ac-Glu-Tyr-Gly-Glu-Phe-NH2). The extraction efficiency of these peptides was estimated by capillary electrophoresis (CE) and high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS).