Étude de la diversité, de la persistance et de la formation du biofilm chez les souches de Listeria monocytogenes dans des abattoirs de porc au Québec

Abstract

Listeria monocytogenes est une bactérie Gram positif, largement présente dans différents types d’environnement, qui peut causer une maladie rare, mais grave, la listériose. Les caractéristiques de cette bactérie, sa pathogénie et sa capacité à survivre dans des conditions difficiles, font d’elle une bactérie qui suscite des inquiétudes particulièrement dans les industries agroalimentaires. Par son caractère ubiquitaire, elle se retrouve aussi dans ce type d’environnement et, par conséquent, peut contaminer les aliments. La persistance de L. monocytogenes dans l’environnement des industries agroalimentaires est un phénomène établi, mais les mécanismes qui y conduisent font encore aujourd’hui débat. Par ailleurs, alors qu’une réglementation stricte a été mise en place dans les industries de transformation de produits prêt-à-manger en rapport avec les risques de contamination par L. monocytogenes, il n’y a, à ce jour que peu d’information disponible au Québec sur la présence de cette bactérie en amont de cette production, soit au niveau de la viande crue. Les objectifs de ce projet de thèse visent, d’une part, à étudier la distribution, la diversité et la persistance des souches de L. monocytogenes dans l’environnement de quatre abattoirs de porcs au Québec; de vérifier la présence de génotypes identifiés comme persistants dans les aliments et les cas de listériose humaine et d’établir les mécanismes de persistance de la bactérie dans l’environnement de ces industries.

Les résultats de ce projet de thèse ont montré qu’après les opérations de nettoyage et de désinfection, la composition de la contamination par L. monocytogenes selon les abattoirs et les secteurs était significativement différente. Ainsi, deux abattoirs ont montré une contamination plus élevée comparativement à un autre abattoir. Une importante diversité de souches de L. monocytogenes est présente dans l’environnement des abattoirs et des usines de découpe de viande. Cette diversité était généralement similaire entre les abattoirs sauf pour un seul abattoir qui a montré une diversité significativement plus élevée. La diversité des souches n’était pas variable en fonction de l’étape du processus d’abattage, soulignant la tolérance de ces souches aux stress spécifiques des différents environnements de ces industries. Cette étude a montré que la présence de souches persistantes de L. monocytogenes était plus importante au niveau des étapes post-éviscération de l’abattage, et particulièrement en découpe. Dans ces conditions, le risque de contamination des produits est très présent. La comparaison des caractéristiques génotypiques des souches persistantes avec celles des souches isolées des aliments transformés et des cas de listériose humaine a montré un lien significatif entre ces souches. La relation entre la fréquence importante de détections de souches présentant ces profils au Québec, mais aussi au Canada et leur persistance dans les nombreux environnements agroalimentaires autres que celui des abattoirs et des salles de découpe des viandes reste à être documentée pour une meilleure compréhension de l’origine des listérioses humaines.

L’étude des différents mécanismes de persistance des souches de L. monocytogenes réalisée au cours de cette thèse a montré que la présence de gènes de résistance aux ammoniums quaternaires (QACs) dans certaines souches est particulièrement associée au caractère de persistance, alors qu’aucune différence dans la capacité à former du biofilm n’a été mise en évidence entre les souches persistantes et celles non persistantes. L’absence de caractère génétique évident et spécifique à la capacité de former le biofilm rend difficile l’association de ce dernier à la persistance des souches de L. monocytogenes. Néanmoins, le biofilm reste un phénomène pouvant expliquer en partie la persistance de L. monocytogenes. Par ailleurs l’étude de l’impact de la concentration en nutriments sur le biofilm de L. monocytogenes a montré qu’en conditions de limitation en nutriments, la structure du biofilm de L. monocytogenes était en forme de nid d’abeille attribuée à la présence d’une plus grande quantité d’ADN extracellulaire. Cette structure confère une meilleure stabilité au biofilm ce qui explique une plus forte biomasse.

Nous avons également démontré ici une association du genre Listeria avec d’autres genres bactériens de l’écosystème microbien résiduel de la surface de l’environnement de découpe des viandes. Ainsi, la co-occurrence de Listeria spp. avec Pseudomonas spp. laisse croire à la présence d’une interaction entre les espèces de ces genres. D’autre part, la présence de plusieurs genres dont Sphingomonas, Paracoccus et Caulobacter est négativement corrélée avec celle de Listeria spp. Ceci ouvre la voie à des études portant sur les interactions spécifiques entre ces genres bactériens et Listeria, et particulièrement l’espèce monocytogenes. L’ensemble de ces études éclaire le phénomène de persistance chez L. monocytogenes : il ne s’agit pas d’un mécanisme unique pour toutes les souches présentant ce caractère mais plutôt le résultat d’une sélection basée sur la résistance aux antimicrobiens, la capacité à former du biofilm en interaction avec d’autres espèces bactériennes, le premier pouvant être nécessaire et suffisant. Cette sélection peut être favorisée également par l’existence d’une niche écologique favorable telle que des endroits difficiles d’accès au nettoyage et à la désinfection.

L’importance de considérer les risques de contamination de L. monocytogenes en amont de la production des produits prêts à manger à base de viande a été démontrée dans ce travail, dans la mesure où, à partir d’une grande diversité de souches présentes dans ce secteur, émerge une population présentant des profils génotypiques similaires à ceux retrouvés dans les aliments et les cas de listériose humaine. Cette étude permettra donc une reconsidération de l’importance d’une surveillance cohérente de L. monocytogenes en amont de la production de prêt à manger, afin de limiter ainsi les risques de contamination des matières premières des industries de transformation.

Listeria monocytogenes is a Gram-positive bacterium widely distributed in various types of environment and can cause listeriosis, a rare but serious disease. The characteristics of this bacterium related to its pathogenesis and its ability to survive in harsh environments make it a harmful bacterium especially in the agri-food industries. Indeed, being an ubiquitous bacterium, it is also found in this type of environment leading to food contamination. The persistence of L. monocytogenes in the environmental food processing plants is a well-known phenomenon, but the mechanisms of persistence are still debated today. In addition, while strict regulations have been established in ready-to-eat industries in relation to the risk of contamination by L. monocytogenes, there is currently no information on the presence of this bacterium in early steps of pork product production in Canada. The aims of this project were 1) to investigate the distribution, diversity and persistence of L. monocytogenes isolates across slaughtering and cutting processes in four slaughterhouses, 2) to evaluate the association between the persistence attribute of L. monocytogenes genotypes and their detection in food and human listeriosis cases and 3) to study mechanisms involved in the persistence of L. monocytogenes, including biofilm formation ability, resistance to disinfectants and interaction with other bacteria from meat conveyor surfaces.

Results showed that after cleaning and disinfection operations, the composition of L.monocytogenes contamination according to slaughterhouses and sectors was significantly different. Thus, two slaughterhouses showed higher contamination compared to another slaughterhouse. Results have shown also that a significant diversity of L. monocytogenes strains was present in the environment of slaughterhouses and cutting areas. Overall, the diversity did not vary depending on slaughterhouses except for one slaughterhouse which exhibited a higher strain diversity. According to the stage of slaughter process, this diversity was not variable underlying the tolerance of these strains to the stress encountered within the different environments in these plants. This study showed that the presence of persistent strains of L. monocytogenes in the post-evisceration stages was greater, particularly in cutting areas, suggesting a possibility of repeated contamination of meat products. When comparing the genetic profiles of persistent strains with strains isolated from processed and ready-to-eat foods and human listeriosis cases, a significant association was found, suggesting a persistence in other processing environments in addition to slaughterhouses.

Our studies of the different persistence mechanisms of L. monocytogenes strains have shown that Quaternary ammonium compounds (QAC) resistance genes are particularly associated with persistent strains while no difference in the ability to generate a biofilm was observed between persistent and non-persistent strains. The lack of obvious genetic attribute(s) and specificity in the various isolates biofilm formation ability makes it difficult to solely attribute to the latter to the persistence of L. monocytogenes strains. Nevertheless, biofilm remains a phenomenon that can partly explain the persistence of L. monocytogenes. Furthermore, the study of the co-occurrence of Listeria spp. with other bacterial genera of the cutting surfaces microflora showed that Listeria spp. co-occurs with Pseudomonas spp. suggesting a possible interaction between species from these two genera. In the other hand, several other genera, of which Sphingomonas, Paracoccus and Caulobacter, negatively affect Listeria, which would suggest that these bacteria inhibit or limit the growth of the genus Listeria, and potentially L. monocytogenes, by competition for colonizing this habitat or, more particularly, for nutrients.

Studies of these mechanisms have demonstrated that persistence of L. monocytogenes could not be explained by a single mechanism for all strains but through a selection phenomenon based on one or several attributes such as antimicrobial resistance, biofilm formation, and capacity to interact with other bacterial species. This selection pressure can also be affected by the existence of a favorable ecological niche such as difficult areas to access to disinfect.

In conclusion, the importance of contamination risks by L. monocytogenes in the pig slaughterhouses was demonstrated by the presence of a great diversity of strains at this level but, more importantly, by the finding that the likelihood to recover persistent strains may be enhanced through resistance to industrials disinfectants and, to a lesser extent, by biofilm formation. These persistent strains shared similar genetic profiles to those found in foods and human listeriosis. This study supports the importance of a consistent and comprehensive monitoring of L. monocytogenes upstream of the ready-to-eat production, as a tool for limiting the risk of contamination of the raw materials of the processing industries.