Génération de lignées de poissons-zèbres par génie génétique dans le cadre de l'étude du gène C9orf72

Abstract

Une mutation intronique du gène C9orf72 est une cause prépondérante de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte. Cependant, la fonction de C9orf72 demeure incertaine. Heureusement, les modèles animaux sont une excellente façon d’en faire l’étude in vivo dans des systèmes complexes. Conséquemment, pour étudier la fonction et l’expression de C9orf72, nous avons tenté de développer 3 lignées de poissons-zèbres pour lesquelles des étiquettes 12xhistidines ou eGFP devaient être insérés par CRISPR/Cas9 près du N et C terminal de C9orf72. Surprenamment, ces modifications furent mal tolérées durant le développement, empêchant l’obtention de sujets F0 adultes en mesure de transmettre un tag inséré. Pour étudier l’effet d’une invalidation persistante de C9orf72 chez le poisson, une lignée présentant une délétion près du N-terminal menant à un knock-out fonctionnel de C9orf72 a été développée des poissons injectés pour l’insertion de 12xHistidine. Nos résultats préliminaires suggèrent un phénotype au niveau de la mobilité et de la mortalité. De plus, deux lignées de poissons transgéniques exprimant le gène C9orf72 humain, seul ou marqué au eGFP, ont été développées par Tol2 pour étudier la localisation de C9orf72 et l’effet de sa surexpression. Ces lignées, une fois validées et caractérisées, permettront d’ouvrir de nouvelles perspectives pour caractériser la fonction et l’expression de C9orf72 ainsi que la modélisation de la SLA. Il semble donc que la perte d'un allèle ou une haplo-insuffisance du gène C9orf72 est mal tolérée, mais que la transgenèse, par addition d'un troisième allèle, permettrait l'étude de C9orf72 in vivo.

An intronic mutation in the gene C9orf72 is the most prevailing cause of Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), an adult onset neurodegenerative disease of the motoneurons. Despite this, the function of C9orf72 remains uncertain. As animal models are an excellent way to study gene function and expression in vivo in complex systems, by using the CRISPR/Cas9 system we attempted to generate 3 lines of zebrafishes for which 12xhistidines or eGFP tags were inserted near either the N or C terminal of C9orf72. Surprisingly, these modifications were ill tolerated during the development, preventing us from obtaining F0 specimens able to pass on the inserted tag for any of our lines. To study the effects of a persistent knock-out of C9orf72 in the zebrafish, a line with deletions near the N-terminal, resulting in a functional knock-out of C9orf72, was obtained from the fishes injected for the 12xHistidine insertion. Preliminary results indicate a higher mortality rate and decrease mobility phenotypes. Additionally, two transgenic zebrafish lines expressing human C9orf72 alone or with eGFP were generated, using Tol2 in order to study C9orf72 localisation and the effect of its overexpression namely on morphology, development and the central nervous system. These lines, once validated and characterised will open new avenues to determine the role and subcellular localization of C9orf72, as well as for modeling ALS. Thus, it appears that the loss of an allele or haploinsufficiency of the C9orf72 gene is ill tolerated, but that transgenesis, by addition of a third allele, may allow for in vivo study of C9orf72.