Mécanismes modulant la stabilité de l’ARNm alphaENaC des cellules épithéliales alvéolaires dans un environnement inflammatoire

Abstract

Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé dans les cellules épithéliales alvéolaires joue un rôle important dans la clairance liquidienne à la naissance et lors d’un syndrome de détresse respiratoire aigu (SDRA). Des travaux préliminaires dans le laboratoire ont montré que le TNF-α régule à la baisse l’expression de l’ARNm αENaC en partie via une modulation post-transcriptionnelle de sa stabilité. Dans les travaux présentés dans ce mémoire, cinq séquences du 3’UTR αENaC qui sont hautement conservées (CS) dans différentes espèces ont été étudiées pour déterminer l’impact de chacune d’elle dans la modulation de l’ARNm αENaC en conditions basales ainsi qu’en présence de TNF-α. Pour étudier l’implication de celles-ci dans la modulation de l’ARNm αENaC, un modèle Tet-Off a été utilisé pour inhiber l’expression du transcrit à l’aide de la doxycycline. Les niveaux de transcrit dans le temps ont été estimés par RT-qPCR. Avec cette technique, la demi-vie de l’ARNm αENaC est de ~100 min. Des mutants de délétion ponctuelle du 3’UTR ont été générés en retirant spécifiquement les domaines CS1 (31pb), CS3 (22pb), CS2&3 (82pb), CS4&5 (74pb), CS1-5 (187pb) et CS3+ (165pb). Nos résultats montrent que la délétion de chacune des CS affecte leur demi-vie respective à 169 min, 172 min, 246 min, 193 min, 208 min et 237 min. La stabilité des différents mutants a ensuite été évaluée en présence de TNF-α (une cytokine retrouvée dans les poumons de patients atteints de SDRA). La courbe de dégradation de l’ARNm avec son 3’UTR complet observée est différente en présence de TNF-α de celle observée en condition basale. La courbe prend allure biphasique avec une dégradation rapide suivit d’un plateau à environ 50% de l’expression du contrôle (t=0). La même observation a été faites pour le mutant de délétion CS1-5. Nous concluons donc que de façon générale le 3’UTR de l’ARNm αENaC, via les domaines conservés identifiés, est impliqué dans la déstabilisation du transcrit. Les CS ne sont pas impliquées dans le mécanisme post-transcriptionnel par lequel le TNF-α fait chuter l’expression de l’ARNm αENaC. Il n’en demeure pas moins que d’autres séquences du 3’UTR pourraient jouer un rôle important dans la dégradation rapide de l’ARNm αENaC durant l’inflammation ou lors d’une lésion pulmonaire.

The epithelial sodium channel (ENaC) expressed in alveolar epithelial cells plays an important role in lung liquid clearance at birth and in acute respiratory distress syndrome (ARDS). Preliminary work in the laboratory has shown that TNF-α downregulates expression of αENaC mRNA in part via post-transcriptional modulation of its stability. In the present study, five 3'UTR αENaC sequences that are highly conserved (CS) across different species were studied to determine the impact of each of them on the modulation of αENaC mRNA under basal conditions, as well as in the presence of TNF-α. To study the involvement of these CS on the modulation of αENaC mRNA, a Tet-Off model was used to inhibit transcript expression using doxycycline. Transcript levels over time were estimated by RT-qPCR. With this technique, the half-life of αENaC mRNA is ~100 min. Punctual deletion mutants of 3'UTR were generated by specifically removing the CS1 (31pb), CS3 (22bp), CS2&3 (82bp), CS4&5 (74bp), CS1-5 (187bp) and CS3+ (165bp) domains. Our results show that the deletion of each CS affects their respective half-lives at 169 min, 172 min, 246 min, 193 min, 208 min and 237 min. The stability of the different mutants was then evaluated in the presence of TNF-α (a cytokine found in the lungs of patients with ARDS). In the presence of the complete 3’UTR, the degradation curve of the mRNA in presence of TNF-α was different from the one observed in under basal conditions. In presence of TNF-α, the curve turns biphasic with a rapid degradation followed by a plateau at about 50% of the expression level. The same thing was observed for the deletion mutant CS1-5. We therefore conclude that in general the 3'UTR of αENaC mRNA via the conserved domains is involved in the destabilization of the transcript. CSs studied did not contribute to the decreased expression of αENaC mRNA in the presence of TNF-α. However, we cannot exclude the possibility that other 3’UTR sequences could play an important role in the rapid degradation of αENaC mRNA during inflammation or lung injury.