Régulation de l’activité de Dicer par TRBP dans la biogénèse des micro-ARN

Abstract

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants ayant un rôle dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes. Ils font partie du complexe de répression induit par les miARN (RNA-induced silencing complex; RISC) où ils servent de guide pour cibler des ARN messagers (ARNm) par complémentarité de séquence et inhibent leur traduction. Les miARN ont le potentiel de réguler la traduction de pratiquement toutes les protéines cellulaires, ce qui leur confère un rôle central dans plusieurs processus cellulaires, dont le développement de l’organisme. Afin d’être fonctionnels, les miARN doivent passer par une voie de biogénèse hautement régulée où ils sont d’abord transcrits, puis clivés en deux temps par les endonucléases Drosha et Dicer et, finalement, chargés sur Argonaute (AGO) pour former le complexe RISC. Cette thèse s’intéresse à l’étape de clivage par Dicer et sa régulation par le cofacteur TRBP, protéine pouvant à la fois lier Dicer et son substrat. Le premier objectif de cette thèse est de développer un nouveau protocole pour l’expression et la purification de la protéine Dicer humaine afin de faciliter sa caractérisation in vitro en améliorant les rendements limités des méthodes existantes. Nous avons optimisé l’expression de Dicer dans un système d’expression basé sur des cellules humaines HEK293-6E cultivées en suspension. Ensuite, nous avons développé un protocole de purification en 3 étapes permettant la purification de Dicer en une seule journée, où chacune des étapes a été soigneusement optimisée pour minimiser les pertes et maximiser la stabilité de Dicer. Ensuite, par des études biophysiques de SEC-MALS et microscopie électronique à coloration négative, nous avons confirmé que Dicer était bien repliée sous forme monomérique. Finalement, nous avons fait la caractérisation biochimique de Dicer en mesurant sa liaison à un pre-miARN par études de retard sur gel et des études de cinétique à l’état-stationnaire. Ces expériences de cinétique nous ont permis de déterminer de nouvelles valeurs de kcat et KM qui concordent avec un modèle impliquant un changement de conformation du complexe Dicer-substrat avant la réaction de clivage. Le deuxième objectif est de caractériser l’effet de TRBP sur l’activité de Dicer. Pour ce faire, nous avons testé quelques pre-miARN en présence de TRBP et montré que cette dernière pouvait être un activateur ou un inhibiteur de Dicer. En effet, TRBP active Dicer à faible concentration de substrat alors qu’elle inhibe Dicer à forte concentration de substrat. Nous avons ensuite caractérisé ce mécanisme enzymatique de manière détaillée par la combinaison d’expériences de liaison et de cinétique à l’état-stationnaire. Notre modèle final montre qu’une faible concentration de TRBP est nécessaire afin d’obtenir un effet d’activation à faible concentrations de substrat. Cela suggère que TRBP active Dicer sans modifier sa grande spécificité pour son substrat. Ces nouveaux résultats suggèrent que TRBP a évolué de manière à pouvoir activer efficacement Dicer sans modifier la spécificité de l'enzyme.

Micro-RNAs (miRNA) are small non-coding RNAs that act as post-transcriptional gene regulators. They are part of the RNA-induced silencing complex (RISC) where they serve as guides to target mRNAs by sequence complementarity and inhibit their translation. Together, miRNAs can regulate the translation of virtually every protein in the cell. This confers miRNAs a central role in various cellular processes such as the development of organisms. To be functional, miRNA must undergo maturation through a highly regulated pathway where they are first transcribed, then cleaved in two steps by endonucleases Drosha and Dicer and, finally, loaded onto the Argonaute protein (AGO) to form the RISC complex. This thesis focuses on the Dicer cleavage step and its regulation by the TRBP cofactor, which is a protein that can simultaneously bind Dicer and its pre-miRNA substrate. The first objective of the thesis is to develop a new protocol for the expression and purification of human Dicer with the intent to improve the yields of existing methods and facilitate its in vitro characterization. We optimized Dicer expression in a human cell expression system that uses an engineered HEK93-6E cell line grown in suspension. Then, we developed a 3-step purification protocol allowing for Dicer purification in a single day. Moreover, these steps were carefully optimized to minimize losses and maximize Dicer stability. The purified Dicer was then analyzed using SEC-MALS and negative-stain EM to confirm that it was a well-folded monomer. Finally, we biochemically characterized Dicer by measuring its binding to a pre-miRNA substrate by EMSA and steady-state kinetic studies. Through these experiments, we calculated new values of kcat and KM that are consistent with a mechanism that involves a conformational change of the Dicer-substrate complex prior to the cleavage step. The second objective was to characterize the effect of TRBP on Dicer activity. To do this, we first tested different pre-miRNA substrates with Dicer in presence of TRBP and showed that TRBP was both an activator and inhibitor of Dicer. Indeed, TRBP is an activator at low substrate concentration and an inhibitor at higher concentration. Next, we characterized the detailed mechanism of the effect of TRBP by a using a combination of binding and steady-state kinetic experiments. Our final model shows that low TRBP concentration is necessary for activation of Dicer activity at low substrate concentration. Our model suggests that TRBP exerts its activation function without reducing Dicer’s specificity for its substrate. These new results suggest that TRBP evolved to efficiently activate Dicer without modifying the specificity of the reaction.