Implication des topoisomérases de type 1A dans la réplication stable et constitutive de l'ADN

Abstract

La réplication normale de l’ADN chez Escherichia coli débute à oriC. Cependant, pendant la transcription, certains facteurs (rnhA-, surenroulement négatif) peuvent favoriser la formation d’un R-loop, une structure trimérique d’ADN-ARN qui peut servir d’origine oriK pour la réplication stable et constitutive de l’ADN (cSDR). Des évidences génétiques suggèrent que les problèmes de croissance, de ségrégation et de filamentation du double mutant topA topB sont partiellement dus à la réplication cSDR. Afin de confirmer cette observation, ainsi que de comprendre le rôle régulateur des topoisomérases 1A durant la réplication dépendante des R-loops, nous avons développé une nouvelle technique permettant la détection et la mesure du cSDR in vivo à un niveau cellulaire. La croissance des cellules en présence de spectinomycine inhibe la réplication initiée à oriC sans affecter le cSDR. La synthèse d’ADN est alors mesurée par l’incorporation de l’EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine), un analogue de la thymidine, au cours de la réplication de l’ADN. La détection des molécules d’EdU polymérisées dépend ensuite de leur liaison avec le fluorochrome Alexa Fluor 488 par une réaction «click-it». Le taux de fluorescence et la quantité de cellules ayant incorporé l’analogue est finalement mesuré par la cytométrie en flux. Grâce à ce protocole, nous avons pu confirmer la présence de réplication cSDR dans le mutant topA topB. De plus, nous avons détecté que le taux de réplication cSDR dans ce double mutant est supérieur à celui détecté dans le mutant topA. Ceci suggère que la délétion de topB amplifie les phénotypes liés au cSDR dans le mutant topA. Cependant, aucune réplication SDR n’a été détectée au sein du mutant topB, et la délétion de topB dans le mutant rnhA n’aggrave pas ses défauts comme elle le fait pour le mutant topA. Ceci suggère que la Topo III partage une fonction avec la Topo I dans la ségrégation des chromosomes, et que cette fonction est essentielle lorsque la cellule fait du cSDR. Ces résultats indiquent également que la Topo I est la principale Topo 1A impliquée dans la régulation des R-loops et du cSDR.

Normal DNA replication in Escherichia coli begins at oriC. However, during transcription, certain factors (rnhA-, negative supercoiling) may trigger the formation of an R-loop, a DNA-RNA hybrid which can serve as a primer for constitutive stable DNA replication (cSDR). Recent genetic evidence has suggested that growth, segregation and filamentation defects in the topA topB double mutant are partially linked to cSDR. To confirm these observations and to better understand the function of topoisomerase 1A in the regulation of R-loop-dependant replication, we developed a new technique which can detect and measure cSDR in vivo at the cellular level. Growing cells are first exposed to spectinomycin, which prevents them from initiating replication at oriC, without affecting cSDR. DNA synthesis is next measured by the incorporation of a thymidine analogue, EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine). The detection of these incorporated molecules is accomplished through their interaction with the Alexa Fluor 488 dye, using a click-it reaction. The level of fluorescence is then measured by flow cytometry. Using this protocol, we were able to confirm the presence of cSDR in the topA topB E. coli mutant. Furthermore, we detected a higher level of cSDR in this double mutant than in the topA single mutant. These results suggest that topB suppression amplifies cSDR-related phenotypes in the topA mutant. However, no cSDR was detected in the topB mutant, and topB suppression in the rnhA mutant did not magnify its cSDR-related phenotypes. We thus propose that the topoisomerase III enzyme shares an important function with topoisomerase I in chromosome segregation, and also that this function is essential when the cell undergoes cSDR. Our results also demonstrated that Topo I is the major Topo 1A involved in R-loop and cSDR regulation.