Mesure de l’activité de la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT), une enzyme impliquée dans la biogenèse des HDL, par chromatographie liquide - spectrométrie de masse (LC-MS)

Abstract

La lécithine : cholestérol acyltransférase, ou LCAT, est la seule enzyme plasmatique capable d’estérifier le cholestérol des lipoprotéines circulantes, une fonction importante dans la biogenèse des lipoprotéines de haute densité HDL et le transport inverse du cholestérol. Son activité est définie comme le taux d’estérification fractionnel du cholestérol libre (CL) des HDL (FERHDL). Le FERHDL est un biomarqueur candidat du risque cardiovasculaire. La réaction d’estérification implique l’hydrolyse d’un acide gras estérifié à la phosphatidylcholine (PC) et son transfert au CL, résultant en la formation d’un ester de cholestérol (CE) et d’une lysophosphatidylcholine (LPC). L’objectif de ce travail était de faire la preuve de concept d’une nouvelle méthode de mesure de l’activité LCAT par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse (LC-MS), qui permet d’identifier et quantifier simultanément tous les substrats et produits de la LCAT. Avec la méthode LC-MS, il a été possible de mesurer le FERHDL comme avec la méthode enzymatique (méthode de référence pour le cholestérol libre), mais aussi des changements au niveau de lipides spécifiques. Les LPC étaient de bons marqueurs candidat de l’activité LCAT, leur abondance étant augmentée de plus de 40% suite à l’incubation. L’activité LCAT a aussi été mesurée dans des plasmas humains enrichis de plusieurs doses de LCAT humaine recombinante et les doses de 4 et 8 μg/mL suffisaient à produire des différences significatives, comparées au plasma natif, pour 5 espèces lipidiques outre le CL: les LPC(16:0) et LPC(18:0) et les PC(14:0|18:2), PC(16:0|16:1) et PC(16:0|18:0). Enfin, l’analyse de l’activité LCAT sur des échantillons de plasma humain de la Biobanque de l’Institut de Cardiologie de Montréal (50 témoins et 50 cas ayant une maladie coronarienne athérosclérotique) a permis d’étudier la modulation des espèces lipidiques dans des échantillons plus complexes qu’un groupe de plasma. De ces lipides, la PC(34 :3) était particulièrement intéressante. Son abondance était plus diminuée par l’incubation du plasma à 37°C chez les cas que chez les témoins, ce qui en fait un candidat comme biomarqueur de l’activité de la LCAT. L’application de la LC-MS à l’étude de la LCAT permet donc une meilleure compréhension des changements lipidiques lors de l’incubation du plasma, ce qui ouvre la voie à la découverte de biomarqueurs.

The lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) is the only plasmatic enzyme capable of esterifying cholesterol molecules present in circulating plasma lipoproteins, a function critical for high-density lipoproteins (HDL) biogenesis and reverse cholesterol transport. Its activity is defined as the fractional esterification rate of free cholesterol of HDL molecules (FERHDL), which is a potential biomarker of cardiovascular risk. The cholesterol esterification reaction is initiated by the hydrolysis of a fatty acid esterified to a phosphatidylcholine molecule (PC) and its subsequent transfer on the hydroxyl group of free cholesterol, resulting in the synthesis of a cholesteryl ester (CE) and a lysophosphatidylcholine (LPC). The objective for this project was to make the proof of concept of a novel method of LCAT activity measurement by liquid chromatography – mass spectrometry (LC-MS), which allows simultaneous identification and quantification of each substrates and products of the LCAT reaction. With this method, FERhdl was measured as with the standard enzymatic method (reference method for measurements of free cholesterol), but changes in specific lipid species was also evaluated. For example, a couple LPC were good candidates as markers of LCAT activity, as their abundance was augmented by at least 40% after incubation of plasma. LCAT activity was also measured in human plasma spiked with different concentrations of recombinant human LCAT and the 4 and 8 μg/mL doses were enough to measure significant differences from the native plasma in 5 lipid species: LPC(16:0), (LPC(18:0), PC(14:0|18:2), PC(16:0|16:1) and PC(16:0|18:0) . Finally, LCAT activity analysis in human plasma samples from the Montreal Heart Institute’s Biobank (50 controls and 50 cases which had a coronary atherosclerotic disease) allowed us to study the modulation of lipids in a more heterogeneous samples than pooled plasma samples. Of these lipids, PC(34:3) was lowered more following incubation of plasma in cases than in controls, making it a candidate biomarker for LCAT activity. In conclusion, application of LC-MS to the study of LCAT gave us a better understanding of lipid changes during plasma activation and opens the way to biomarker discovery.