Identification of novel regulators of estrogen receptor alpha signalling and proliferation in breast cancer

Abstract

Le cancer du sein est un des cancers les plus fréquents chez les femmes, une canadienne sur neuf étant diagnostiquée au cours de sa vie. Le cancer du sein est une maladie hétérogène et le choix thérapeutique et le pronostic sont guidés par stratification des patientes sur la base de marqueurs moléculaires pour le récepteur des estrogènes α (ERα), le récepteur de la progestérone (PR) et/ou le récepteur membranaire HER2. Plus de 70% des tumeurs mammaires expriment ERα, un facteur de transcription inductible par les ligands. Une stimulation par l’estradiol permet la liaison du récepteur aux éléments de réponse aux estrogènes (ERE) dans les séquences régulatrices de gènes cibles, en association avec des cofacteurs transcriptionnels, et modifie les profils d’expression des gènes, augmente la prolifération cellulaire et accélère la croissance tumorale. Bien qu’il ait été démontré que plusieurs voies de signalisation influencent la fonction de ERα, les gènes capables d’affecter cette fonction restent à caractériser de manière exhaustive. Dans cette étude, nous décrivons la conception, l’optimisation et l’exécution d’un protocole de criblage de shRNA à l’échelle du génome en vue d’identifier les gènes modulant l’expression de ERα, sa fonction en tant que facteur de transcription et la prolifération dépendante des estrogènes dans une lignée de cancer du sein humaine ERα-positive (luminale) exprimant de manière stable un vecteur rapporteur sous contrôle d’un promoteur répondant aux estrogènes. Nous avons validé notre méthode de criblage en déterminant les effets d’une suppression de l’expression de ERα et de celle d’un de ses cofacteurs connus, NRIP1, comme preuve de principe. Notre criblage à l’échelle du génome a confirmé plusieurs régulateurs connus de la signalisation par ERα (NCOA1, NCOA2, NRIP1, FOXA1 et GATA3). Nous avons aussi identifié plusieurs régulateurs de l’expression de ERα, incluant l’acétyl-transférase de lysines KAT6A. La suppression de l’expression de KAT6A diminue l’expression du transcrit de ERα et de sa protéine, and conduit à des profils d’expression des gènes comparables à ceux obtenus suite à la suppression de l’expression de ERα. Nous avons aussi identifié un nombre de candidats régulateurs de la signalisation par ERα, incluant une sous-unité du complexe de remodelage de la chromatine CHRAC. La suppression de l’expression de CHRAC1 résulte en un effet répressif sur les gènes cibles des estrogènes, y compris ceux jouant un rôle dans le contrôle du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN, et sur la prolifération de notre modèle cellulaire. Cette étude a permis de révéler de nouveaux gènes et mécanismes moléculaires de signalisation affectant l’expression et/ou l’activité transcriptionnelle de ERα et la prolifération de cellules ERα-positives, et ouvre de nouvelles avenues pour explorer des approches de prévention et/ou traitement de la résistance aux antiestrogènes.

Breast cancer remains the most commonly diagnosed cancer among women, with one in nine Canadian women expected to be diagnosed within her lifetime. Breast cancer is a heterogeneous disease, and stratification of patients into cohorts based on the expression of the molecular markers estrogen receptor α (ERα), progesterone receptor (PR) and/or HER2 helps dictate choice of therapy and predict disease prognosis. Over 70% of breast tumours express ERα, a ligand-inducible transcription factor. Stimulation with estradiol (E2) leads to receptor binding to estrogen response elements (ERE) in target gene regulatory sequences in association with transcription cofactors, and results in altered gene expression, increased cell proliferation and accelerated tumour growth. While a number of pathways have been shown to influence ERα signalling, an exhaustive study of genes affecting ERα signalling has not yet been published. In this study, we describe the design, optimization and execution of an arrayed genome-wide shRNA screening protocol to identify genes modulating ERα expression, signalling and E2-dependent proliferation in a human ERα-positive luminal breast cancer cell line stably expressing a luciferase reporter under the control of an estrogen-responsive promoter. We have validated our screening assays by monitoring the effects of ERα knockdown and knockdown of the known ERα cofactor, NRIP1, as a proof of principle. Our screen confirmed a number of known regulators of ERα signalling (NCOA1, NCOA2, NRIP1, FOXA1 and GATA3). We also identified several novel regulators of ERα expression, including the lysine acetyl transferase, KAT6A. Knockdown of KAT6A decreased the expression of ERα transcript and protein, and led to gene expression patterns comparable to those obtained following ERα knockdown. In addition, we identified a number of candidate regulators of ERα signalling, including the chromatin assembly complex CHRAC. Knockdown of CHRAC1 resulted in a strong repressive effect on estrogen target genes included those involved in cell cycle control, cell proliferation and DNA repair, and decreased proliferation of our model cell line. This study gives insight into previously unknown genes and molecular signalling pathways affecting expression and/or transcriptional activity of ERα and proliferation of ERα-positive cancer cells, and provides novel avenues to explore to prevent and/or circumvent antiestrogen resistance.