The role of mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway and synaptic protein GABAA-R in cortical GABAergic cell connectivity

Abstract

Quelque 30 % de la population neuronale du cortex mammalien est composée d’une population très hétérogène d’interneurones GABAergiques. Ces interneurones diffèrent quant à leur morphologie, leur expression génique, leurs propriétés électrophysiologiques et leurs cibles subcellulaires, formant une riche diversité. Après leur naissance dans les éminences ganglioniques, ces cellules migrent vers les différentes couches corticales. Les interneurones GABAergiques corticaux exprimant la parvalbumin (PV), lesquels constituent le sous-type majeur des interneurones GABAergiques, ciblent spécifiquement le soma et les dendrites proximales des neurones principaux et des neurones PV+. Ces interneurones sont nommés cellules à panier (Basket Cells –BCs) en raison de la complexité morphologique de leur axone. La maturation de la connectivité distincte des BCs PV+, caractérisée par une augmentation de la complexité de l’axone et de la densité synaptique, se déroule graduellement chez la souris juvénile. Des travaux précédents ont commencé à élucider les mécanismes contrôlant ce processus de maturation, identifiant des facteurs génétiques, l’activité neuronale ainsi que l’expérience sensorielle. Cette augmentation marquante de la complexité axonale et de la synaptogénèse durant cette phase de maturation suggère la nécessité d’une synthèse de protéines élevée. La voie de signalisation de la cible mécanistique de la rapamycine (Mechanistic Target Of Rapamycin -mTOR) a été impliquée dans le contrôle de plusieurs aspects neurodéveloppementaux en régulant la synthèse de protéines. Des mutations des régulateurs Tsc1 et Tsc2 du complexe mTOR1 causent la sclérose tubéreuse (TSC) chez l’humain. La majorité des patients TSC développent des problèmes neurologiques incluant des crises épileptiques, des retards mentaux et l’autisme. D’études récentes ont investigué le rôle de la dérégulation de la voie de signalisation de mTOR dans les neurones corticaux excitateurs. Toutefois, son rôle dans le développement des interneurones GABAergiques corticaux et la contribution spécifique de ces interneurones GABAergiques altérés dans les manifestations de la maladie demeurent largement inconnus. Ici, nous avons investigué si et comment l’ablation du gène Tsc1 perturbe le développement de la connectivité GABAergique, autant in vitro que in vivo.

Pour investiguer le rôle de l’activation de mTORC1 dans le développement d’une BC unique, nous avons délété le gène Tsc1 en transfectant CRE-GFP dirigé par un promoteur spécifique aux BCs dans des cultures organotypiques provenant de souris Tsc1lox. Le knockdown in vitro de Tsc1 a causé une augmentation précoce de la densité des boutons et des embranchements terminaux formés par les BCs mutantes, augmentation renversée par le traitement à la rapamycine. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de la voie de signalisation de mTOR affecte le rythme de la maturation des synapses des BCs. Pour investiguer le rôle de mTORC1 dans les interneurones GABAergiques in vivo, nous avons croisé les souris Tsc1lox avec les souris Nkx2.1-Cre et PV-Cre. À P18, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Tsc1flox/flox ont montré une hyperactivation de mTORC1 et une hypertrophie somatique des BCs de même qu’une augmentation de l’expression de PV dans la région périsomatique des neurones pyramidaux. Au contraire, à P45 nous avons découvert une réduction de la densité des punctas périsomatiques PV-gephyrin (un marqueur post-synaptique GABAergique). L’étude de la morphologie des BCs en cultures organotypiques provenant du knock-out conditionnel Nkx2.1-Cre a confirmé l’augmentation initiale du rythme de maturation, lequel s’effondre ensuite aux étapes développementales tardives. De plus, les souris Tg(Nkx2.1Cre);Tsc1flox/flox montrent des déficits dans la mémoire de travail et le comportement social et ce d’une façon dose-dépendante. En somme, ces résultats suggèrent que l’activation contrôlée de mTOR régule le déroulement de la maturation et la maintenance des synapses des BCs. Des dysfonctions de la neurotransmission GABAergique ont été impliquées dans des maladies telles que l’épilepsie et chez certains patients, elles sont associées avec des mutations du récepteur GABAA. De quelle façon ces mutations affectent le processus de maturation des BCs demeuret toutefois inconnu. Pour adresser cette question, nous avons utilisé la stratégie Cre-lox pour déléter le gène GABRA1, codant pour la sous-unité alpha-1 du récepteur GABAA dans une unique BC en culture organotypique. La perte de GABRA1 réduit l’étendue du champ d’innervation des BCs, suggérant que des variations dans les entrées inhibitrices en raison de l’absence de la sous-unité GABAAR α1 peuvent affecter le développement des BCs. La surexpression des sous-unités GABAAR α1 contenant des mutations identifiées chez des patients épileptiques ont montré des effets similaires en termes d’étendue du champ d’innervation des BCs. Pour approfondir, nous avons investigué les effets de ces mutations identifiées chez l’humain dans le développement des épines des neurones pyramidaux, lesquelles sont l’endroit privilégié pour la formation des synapses excitatrices. Somme toute, ces données montrent pour la première fois que différentes mutations de GABRA1 associées à des syndromes épileptiques peuvent affecter les épines dendritiques et la formation des boutons GABAergiques d’une façon mutation-spécifique.

About 30% of the total neuronal population in the mammalian cortex is composed by a very heterogeneous population of GABAergic interneurons. These interneurons differ in their morphology, gene expression, electrophysiological properties and subcellular targets, thus establishing a rich diversity. After birth in the ganglionic eminences these cells migrate to distinct cortical layers. Parvalbumin (PV) expressing cortical GABAergic cells which constitute the major GABAergic subtype specifically targets the soma and proximal dendrites of principal neurons and PV+ cells. These cells are often referred as Basket cells (BCs) because of the intricate morphological complexity of their axons. The maturation of the distinct connectivity of PV+ BCs, characterized by an increase of axon complexity and synapse density, occurs gradually in juvenile mice. Previous studies started to elucidate the mechanisms controlling this maturation process, including genetic factors, neuronal activity and sensory experiences. The striking increase in axonal complexity and synaptogenesis occurring during the maturation phase suggests the requirement for elevated proteins synthesis in order to sustain the developmental process. The Mechanistic Target Of Rapamycin (mTOR) pathway has been implicated in controlling several aspects of neurodevelopment by regulating protein synthesis. Mutations in the regulatory components Tsc1 and Tsc2 of mTOR-Complex1 (mTORC1) cause the disease Tuberous Sclerosis (TSC) in humans. The majority of TSC patients develop neurological problems including seizures, mental retardation and autism. Recent studies investigated the role of mTOR pathway dys-regulation in excitatory cortical cells, however its role in the development of cortical GABAergic interneurons and the specific contribution of altered GABAergic cells in disease manifestation remain largely unknown. Here, we investigated whether and how Tsc1 knockout perturbs GABAergic circuit development, both in vitro and in vivo. To investigate the role of mTORC1 activation in BC development, we knocked out Tsc1 expression, by transfecting Cre-GFP driven by a promoter specific for BCs in cortical organotypic cultures prepared from Tsc1lox mice. Tsc1 knockdown in vitro caused a precocious increase in bouton density and terminal branching formed by mutant BCs, which was reversed by Rapamycin treatment. These data suggest that mTOR pathway hyperactivation affects the timing of BC synapse maturation. To investigate the role of mTORC1 in GABAergic cells in vivo, we bred Tsc1lox mice with Nkx2.1-Cre and PV-Cre mice. At P18, Tg(Nkx2.1Cre),Tsc1flox/flox mice showed both mTORC1 hyperactivation and somatic hypertrophy in BCs along with increased expression of PV in the perisomatic region of pyramidal neurons. In contrast, by P45 we found a reduction of PV-gephyrin (post-synaptic GABAergic marker) perisomatic puncta density. Study of BC morphology in organotypic cultures from the Nkx2.1-Cre conditional knockout confirmed the occurrence of a faster maturation rate initially which however collapsed at later stages. Additionally Tg(Nkx2.1Cre),Tsc1flox/flox mice exhibit Tsc1 dose-dependent deficits in working memory and social behaviour. All together, these results suggest that controlled mTOR activation regulates both the time course and the maintenance of BC synapses. Dysfunction of GABAergic neurotransmission has been implicated in several disease states like epilepsy and in some patients it is associated with mutations in the GABAA receptor. How these mutations affect the BC cell maturation process remains largely unknown. To address this question, we used the Cre-lox strategy to knockout the endogenous GABRA1 gene coding for the GABAA-receptor alpha-1 subunit in single PV-expressing basket cells (BCs) in organotypic cultures. Cell-autonomous loss of GABRA1 reduced the extent of BC innervation field suggesting changes in inhibitory inputs caused by the absence of GABAAR α1 subunit may alter BC development. Over-expression of mutant GABAAR α1 subunits (found in patients diagnosed with epilepsy) show similar effects in terms of BC target coverage. Further studies involved the effect of these human mutations in the development of Pyramidal cell dendritic spines, which are the preferential site for excitatory synapse formation. Altogether, this data show for the first time that different GABRA1 mutations associated with genetic epilepsy syndromes can affect dendritic spine and GABAergic bouton formation in a mutation-specific manner.