Les protéines Staufen et leurs rôles dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes, la réponse aux dommages à l’ADN et le cycle cellulaire

Abstract

Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones. D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN, peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées. D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du cycle cellulaire. Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire.

The various mecanisms of post-transcriptional regulation of gene expression are more and more recognized as essential processes in diverse important physiological phenomenons, like cell proliferation and the DNA damage response (DDR). Two of the proteins implicated in this type of regulation are Staufen1 (Stau1) and Staufen2 (Stau2). They are double-stranded RNA binding proteins contributing to messenger RNA (mRNA) transport, translation control, alternative splicing and are responsible for the degradation of some specific mRNAs. The Staufen proteins are indeed able to associate with particular mRNAs. Interestingly, Stau1 and Stau2 predominantly form complexes with different targets. Recent evidences show the implication of various post-transcriptional regulation mecanisms in the DDR, moreover several RNA binding proteins are involved. Importantly, this response dictates one or several cell fates following damage to the integrity of the cell’s DNA: DNA repair, cell proliferation arrest, apoptosis. We hypothesized that Stau1 and/or Stau2 expression could be affected in response to genotoxic stress, which could consequently modulate the expression and/or the stability of their mRNA targets. Also, our laboratory has recently observed that Stau1 expression varies during the cell cycle. It is elevated up to the beginning of mitosis (prometaphase) and it decreases as cells complete their division. We therefore hypothesized that Stau1 could differentially bind mRNAs in cells blocked in prometaphasis and in asynchronous cells. On the one hand, by using camptothecin (CPT), a DNA damaging agent, to treat cells from the colorectal cancer cell line HCT116, we observed that only the expression of Stau2 is considerably reduced, both at the level of the protein and that of the mRNA. The use of other cytotoxic agents allowed us to confirm this initial observation. We also noted that Stau2 expression is down-regulated even in conditions that do not induce apoptosis, suggesting that the decrease in Stau2 expression may be required for a proper DDR. Indeed, Stau2 overexpression together with the CPT treatment causes a delay in apoptosis induction in HCT116 cells. We also showed that Stau2 down-regulation is due to the regulation of its transcription in response to the genotoxic stress, which necessitates a minimal region in Stau2’s putative promoter. Besides, we identified the E2F1 transcription factor, commonly implicated in the DDR, as a regulator of Stau2 expression. E2F1 thus stimulates an increase in Stau2 expression in non-treated cells, but this up-regulation is abolished in CPT-treated cells, which suggests that CPT could act by inhibiting Stau2 transcriptional activation by E2F1. Finally, we observed that some Stau2-associated mRNAs, which code for proteins implicated in the DDR and apoptosis, are differentially expressed in CPT-treated cells compared to non-treated cells. On the other hand, we identified Stau1-associated mRNAs during prometaphase, when Stau1 expression is at its highest level in the cell cycle, by performing a large-scale study using DNA microarrays in HEK293T cells. We subsequently confirmed the association between Stau1 and some mRNAs of interest, mainly coding for proteins involved in the regulation of cell proliferation and/or mitosis progression. A comparison of the association between Stau1 and these mRNAs in prometaphase-blocked cells with that in asynchronous cells allowed us to notice a preferential association in prometaphase-blocked cells. This suggests a potential increase of the regulation of these mRNAs by Stau1 at that point of the cell cycle. The data presented in this thesis indicate that in all likelihood the post-transcriptional regulation of gene expression controlled by the Staufen proteins happens in part thanks to the modulation of Stau1 and Stau2 expression according to the cellular conditions. We then contemplate that this fluctuation in Staufen proteins expression has consequences on mRNA subsets with which they associate, and that this may mean they have an important role to play in regulating essential physiological processes like DDR and cell cycle progression.