Analyse génotypique des cellules initiatrices de tumeurs exprimant CD133 dans le neuroblastome

Abstract

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente et mortelle chez les jeunes enfants. Il se caractérise par une résistance à la chimiothérapie possiblement en partie dû à la présence de cellules initiatrices de tumeurs (TICs). Des études ont mis en évidence le rôle de CD133 comme un marqueur des TICs dans divers types de cancers. Les buts de notre travail étaient d’abord de démontrer les vertus de TICs des cellules exprimant CD133 et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome avec des polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs), d’effectuer une analyse différentielle entre les TICs et les autres cellules du NB afin d’en identifier les anomalies génétiques spécifiques. Des lignées cellulaires de NB ont été triées par cytométrie de flux afin d’obtenir deux populations: une enrichie en CD133 (CD133high), l’autre faible en CD133 (CD133low). Afin de déterminer si ces populations cellulaires présentent des propriétés de TICs, des essais sur les neurosphères, les colonies en agar mou et les injections orthotopiques de 500 cellules sélectionnées dans 11 souris ont été réalisées. Après une isolation de l’ADN des populations sélectionnées, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 ». Pour vérifier l’expression des gènes identifiés, des Western Blots ont été réalisés. Nos résultats ont démontré que la population CD133 avait des propriétés de TICs in vitro et in vivo. L’analyse génotypique différentielle a permis d’identifier deux régions communes (16p13.3 and 19p13.3) dans la population CD133high ayant des gains et deux autres régions (16q12.1 and 21q21.3) dans la population CD133low possédant des pertes d’hétérozygoties (LOH). Aucune perte n’a été observée. Parmi les gènes étudiés, l’expression protéique d’éphrine-A2 était corrélée à celle de CD133 dans 6 tumeurs et 2 lignées cellulaires de NB. De plus, l’augmentation de la concentration d’anticorps anti-éphrine-A2 dans le milieu diminue la taille des neurosphères. Ainsi, la population CD133high, qui a des vertus de TICs, possède des caractéristiques génotypiques différentes par rapport à celle CD133low. La présence d’éphrine-A2 dans les cellules exprimant CD133 souligne son importance dans le développement des TICs. Ces résultats suggèrent la présence de potentielle cible pour de nouvelles thérapeutiques ciblant les TICs mise en évidence par l’étude génomique.

Neuroblastoma (NB) is the most common and deadly extracranial solid tumor of childhood characterized by a resistance to chemotherapy possibly due to the presence of tumor initiating cells (TICs). Studies showed the role of CD133 as a marker of TICs in various types of cancers. Our goals were first to demonstrate the stemness of TICs expressing CD133 and then, using a global genomic analysis with single nucleotide polymorphism (SNPs), to perform a differential analysis between TICs and other cells of NB to identify the specific genetic abnormalities.

NB cell lines were sorted by flow cytometry to obtain two populations: one enriched in CD133 (CD133high), the other low in CD133 (CD133low). To determine whether these cell populations have TICs properties, we test the ability of cells to form either neurosphères or, colonies in soft agar and we also test their carcinogenic properties by orthotopic injections of 500 selected cells in 11 mice. After a DNA extraction on selected populations, a differential genotyping analysis has been made with Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. To verify the expression of the genes identified, Western blots had been made. Our results have demonstrated that CD133high population presented TICs properties in vitro and in vivo. The differential genotyping analysis allowed identifying two gains common regions (16p13.3 and 19p13.3) in CD133high population and two others loss of heterozygosity (LOH) (16q12.1 and 21q21.3) in CD133low population . No losses were observed. Among the genes studied, ephrin-A2 protein expression was correlated to CD133 expression in 6 NB tumors and 2 NB cell lines. Also, ephrin-A2’s increased concentration influenced the neurospheres by decreasing their size. Thereby, CD133high population, which had TICs properties, possess different genotyping characteristics compared to CD133low population. The presence of ephrine-A2 in cells expressing CD133 emphasizes its importance in the development of TICs. These results suggest the presence of potential target for new therapies targeting the TICs demonstrated by the genomic study.