Caractérisation moléculaire et fonctionnelle de Cif1p, une protéine orpheline impliquée dans le phénomène épigénétique de viabilité de la levure S. pombe en absence de la chaperone calnexine

Abstract

Le repliement des protéines est un processus cellulaire crucial impliquant plusieurs protéines dont la calnexine, une chaperone du réticulum endoplasmique. Notre laboratoire et un autre groupe avons démontré que la calnexine est essentielle à la viabilité de la levure Schizosaccharomyces pombe. Dans le cadre d’études structure-fonction portant sur cette protéine, nous avons découvert un phénomène permettant la viabilité des cellules en absence de la calnexine. Cet état, nommé Cin pour calnexine independence, est induit par un mutant de la calnexine dépourvu du domaine central hautement conservé (Δhcd_Cnx1p). La caractérisation de l’état Cin a révélé plusieurs caractéristiques particulières telle la dominance, sa transmission de façon non-Mendélienne à la progéniture méïotique et sa transmission par des extraits protéiques dépourvus d’acides nucléiques. Toutes ces propriétés suggèrent donc que l’état Cin est médié via un élément de type prion.

Le gène cif1+, pour calnexin independence factor, a été isolé lors de criblages visant à identifier des gènes impliqués dans l’état Cin. Il encode pour une protéine orpheline dont la surexpression induit de façon stable un état de viabilité en l’absence de la calnexine. Cet état diffère génétiquement et phénotypiquement de l’état Cin induit par le mutant Δhcd_Cnx1p préalablement caractérisé, ce qui suggère deux voies parallèles de signalisation du phénomène Cin. Une caractérisation exhaustive de Cif1p a permis de démontrer qu’il ne s’agissait pas du prion responsable de l’état Cin, malgré que cette protéine possède certaines propriétés typiques des prions in vitro. Finalement, Cif1p est une protéine nucléolaire dont la bonne localisation est essentielle à sa capacité à induire l’état Cin. Ceci suggère une interaction entre la fonction essentielle de la calnexine et une fonction exécutée dans le nucléole.

Lors d’études visant à élucider la fonction cellulaire de Cif1p, il a été établi qu’elle interagissait avec certaines protéines de la grosse sous-unité du ribosome telle la protéine L3. Cependant, Cif1p ne co-sédimente pas avec des sous-unités ribosomales assemblées, des ribosomes ou des polysomes. De plus, des cellules contenant une délétion génomique de cif1 voient leur contenu en ribosomes perturbé lors de la phase stationnaire. Il semble donc que Cif1p joue un rôle dans la biosynthèse des ribosomes lors de la phase stationnaire. Ce rôle spécifique à cette phase de croissance coincide avec un clivage de la portion N-terminale de Cif1p, clivage qui a lieu lors de l’entrée des cellules en phase stationnaire. De plus, des études effectuées récemment dans notre laboratoire proposent que la calnexine joue un rôle important dans la signalisation de l’apoptose, et ce particulièrement en phase stationnaire. Ainsi, une voie impliquant Cif1p, sa fonction nucléolaire dans la biosynthèse des ribosomes en phase stationnaire, la calnexine et la médiation de l’apoptose semble se dessiner. D’autres travaux, notamment sur la fonction exacte de Cif1p, le rôle de son clivage et les autres composantes impliquées dans le phénomène Cin nous permettront de dessiner un portrait plus complet de cette voie cellulaire inédite.

Protein folding is a vital process that involves many proteins of the cell. One of them is calnexin, a chaperone of the endoplasmic reticulum. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, calnexin is essential for survival of the cells. During structure-function studies on calnexin, our laboratory discovered a phenomenon allowing the viability of cells without this chaperone. This state, designated Cin for Calnexin INdependence, is induced by a calnexin mutant devoid of the highly conserved central domain (Δhcd_Cnx1p). Characterization of the Cin cells showed several exceptional properties such as dominance, non-Mendelian transmission and transmission via cell extracts devoid of nucleic acids of the Cin state. All these observations suggested that the Cin phenomenon is mediated via a prionic element.

To identify genes implicated in the Cin state, genetic screens were performed. They led to the identification of the cif1+ gene, for calnexin independence factor. This gene encodes an orphan protein, the overexpression of which stably induces a state of viability in the absence of calnexin. Notably, this state is genetically and phenotypically distinct from the previously isolated Cin state arising from Δhcd_Cnx1p expression. This suggests the presence of two parallel pathways both able to signal the induction of the Cin phenomenon. The exhaustive characterization of Cif1p showed that it is not the prion solely responsible for the Cin state, although it displays prion-like properties in vitro. Finally, nucleolar localization of Cif1p is required to induce the Cincif1 state, thus suggesting an unexpected interaction between the vital cellular role of calnexin and a function of the nucleolus.

While investigating Cif1p function in the cell, we observed that it interacts with ribosomal proteins of the large subunit, notably L3, but it does not sediment with assembled ribosomal subunits or whole ribosomes. However, cells containing a genomic deletion of cif1 also have a disrupted ribosome content during stationary phase. Altogether, these results suggest that Cif1p has a role in ribosomal biogenesis during stationary phase. This growth-phase specific role correlates with the occurence during stationary phase of a cleavage in the N-terminal part of Cif1p. Recent studies from our laboratory proposed that calnexin plays an important role in apoptosis signaling, especially in stationary phase. Thus, a pathway implicating Cif1p, its nucleolar function in ribosome biosynthesis in stationary phase, calnexin and apoptosis signaling is starting to emerge. However more studies, notably on the exact function of Cif1p, the role of its cleavage and the other proteins implicated in the Cin state will be necessary to draw the complete scheme of this unprecedented cellular pathway.