L’expression des cyclo-oxygénases et des oxydes nitriques synthases avec les protéines adaptatrices TRAFs dans les cellules progénitrices endothéliales

Abstract

L’interaction du CD40L plaquettaire avec le CD40 exprimé par les mono-lymphocytaires, dont les cellules progénitrices endothéliales (EPCs), médie l’hémostase. Deux sous-types d’EPCs induisent la réparation vasculaire : les early outgrowth cells (EOCs) et les endothelial colony forming cells (ECFCs). Les EOCs expriment des protéines adaptatrices s’associant aux récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TRAFs) nécessaires à la signalisation du CD40. L’association des TRAFs au CD40 contribuerait à la fonction antiplaquettaire d’EOCs prétraitées au CD40L, via la libération de prostacycline (PGI2) ou d'oxyde nitrique (NO). Toutefois, la contribution des TRAFs des ECFCs dans la libération de PGI2 et de NO via la régulation des cyclo-oxygénases (COX) et des NO synthases (NOS) demeure inexplorée. Cette étude vise à comprendre le rôle des TRAFs, COX et NOS dans les ECFCs. Nous avons différencié des EPCs via la culture de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMCs) dans un milieu à croissance endothéliale (EGM-2) et révélé, par microscopie optique et confocale, le phénotype monocytaire de nos EOCs et de cellules endothéliales (ECs) de nos ECFCs, incluant leurs caractéristiques endothéliales par cytométrie en flux. L’expression constitutive de l’eNOS, l’iNOS, la COX-1 et faiblement la COX-2 dans nos ECFCs et ECs, des enzymes absentes de nos EOCs, a été décelée par Western Blot. Le profil d'expression des TRAFs dans nos EOCs, ECFCs, PBMCs et ECs a démontré la présence variée du CD40 et celle des TRAF1, 2, 3, 5 et 6, selon le type cellulaire. En conclusion, nous avons révélé la présence de TRAFs, COX et NOS, ainsi que leur expression différentielle dans les EOCs et ECFCs. Des études portant sur l’association des TRAFs au CD40 éclaireront sur les mécanismes intracellulaires impliqués dans la régulation de la synthèse de PGI2 et de NO et la fonction antiplaquettaire des EPCs.

Platelets secrete CD40L whereas white blood cells such as endothelial progenitor cells (EPCs) express its cognate receptor CD40, the previous dyad allowing hemostasis. Recent evidences revealed the existence of two EPC subtypes implicated in vascular repair: early outgrowth cells (EOCs) and endothelial colony-forming cells (ECFCs). EOCs express adapter proteins, members of the TNF receptor-associated factors (TRAFs), necessary for CD40 signaling, the latter possibly involved in the anti-platelet function of sCD40L-treated EOCs, through prostacyclin (PGI2) and nitric oxide (NO) secretion. However, the TRAFs present in ECFCs which may act upstream of CD40 signaling to regulate the expression of cyclooxygenases (COX) and NO synthases (NOS) are still unexplored. This study aims to investigate the role of TRAFs, COX and NOS in ECFCs. We succeeded in differentiating EPCs by culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in an endothelial growth medium (EGM-2), and showed by optical and confocal microscopy that EOCs display a monocyte-like phenotype whereas ECFCs have an endothelial cell (EC)-like phenotype, both EPC subtypes sharing endothelial features assessed by flow cytometry. Indeed, ECFCs, like ECs, constitutively express eNOS, iNOS, COX-1 and weakly COX-2; whereas EOCs do not constitutively express these NO and PGI2 producing enzymes, as shown by Western Blot. Comparing the expression profile of TRAFs in EOCs, ECFCs, PBMCs and ECs, we found that they all express CD40, TRAF1, 2, 3, 5 and 6. However, their levels of expression vary between the different cell types. Results generated from this project informed on the presence of TRAFs, COX and NOS in EOCs and ECFCs, where further studies on CD40 association with its identified TRAFs in each EPC subtype should shed lights on the downstream intracellular mechanisms involved in the regulation of COX and NOS expression in EOCs and ECFCs, and consequently their anti-platelet function.