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dc.contributor.advisorFerbeyre, Gerardo
dc.contributor.advisorBrakier-Gingras, Léa
dc.contributor.authorCadar, Alexandra Elena
dc.date.accessioned2014-10-03T19:37:57Z
dc.date.availableNO_RESTRICTIONfr
dc.date.available2014-10-03T19:37:57Z
dc.date.issued2014-09-22
dc.date.submitted2014-06
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1866/11057
dc.subjectP53fr
dc.subjectTraduction IRES-dépendantefr
dc.subjectSénescencefr
dc.subjectVileillissementfr
dc.subjectIRES-dependent initiationfr
dc.subjectSenescencefr
dc.subjectAgingfr
dc.subject.otherBiology - Molecular / Biologie - Biologie moléculaire (UMI : 0307)fr
dc.titleÉtude de l’activité des présumés IRES de l’ARN messager de p53fr
dc.typeThèse ou mémoire / Thesis or Dissertation
etd.degree.disciplineBiochimiefr
etd.degree.grantorUniversité de Montréalfr
etd.degree.levelMaîtrise / Master'sfr
etd.degree.nameM. Sc.fr
dcterms.abstractLe facteur de transcription p53 joue un rôle crucial dans la suppression de tumeurs et dans la sénescence cellulaire. Selon la littérature, l’ARN messager de p53 contient deux sites d’entrée interne des ribosomes (IRES), un dans la région 5’ non-traduite et l’autre au début de la région codante. L’utilisation de ces IRES devrait activer la synthèse de p53 en conditions de stress, comme dans la sénescence. Notre but était d’identifier les éléments-clés qui contrôlent l’activité des IRES de p53 et d’étudier leur comportement dans la sénescence. Nous avons construit des vecteurs bicistroniques à deux luciférases contenant le gène de la Renilla (Rluc), traduit via le mécanisme classique coiffe-dépendant, une région intercistronique, contenant une des séquences IRES de p53, et le gène de la luciole (Fluc), dont la traduction dépend de cet IRES. L’activité IRES a été évaluée par le rapport des activités Fluc/Rluc dans des extraits cellulaires de HEK293T et de fibroblastes primaires humains. Nous avons inséré une structure précédant l’IRES évitant qu’une translecture ou une réinitiation de la traduction puisse conduire à la synthèse de Fluc. Nous avons vérifié l’absence de promoteur cryptique dans les IRES et nous avons construit des vecteurs contenant la séquence complémentaire inversée (SERI) des IRES. Nous avons observé que l’efficacité de traduction via les IRES de p53 ou les séquences SERI est semblable. De plus, la traduction de Fluc via les présumés IRES de p53 ne représente qu’environ 1% de la traduction de Fluc via une initiation coiffe-dépendante. L’activité des prétendus IRES ne semble pas augmenter en conditions de sénescence. Enfin, nous avons introduit une région structurée dans la région 5’UTR du messager bicistronique. Cette structure a bloqué la traduction coiffe-dépendante mais aussi la traduction IRES-dépendante. L’ensemble de nos résultats nous conduit à affirmer que l’ARN messager de p53 ne contient pas d’IRES et nous suggérons que la faible activité Fluc observée résulterait d’un épissage cryptique conduisant à l’apparition d’un messager dont la traduction génère une portion de Rluc fusionnée à Fluc. Nos résultats sont en accord avec des données rapportées dans la littérature démontrant que l’existence de la plupart des IRES cellulaires est contestée. Un ensemble de contrôles rigoureux doit être appliqué à l’étude de tout IRES présumé avant d’affirmer son existence. Le système à deux luciférases, considéré comme le modèle de choix pour l’étude des IRES, peut en fait révéler diverses anomalies de l’expression des gènes.fr
dcterms.abstractp53 is a transcription factor that plays a crucial role in tumor suppression and cellular senescence. According to the literature, the p53 mRNA contains two internal ribosome entry sites (IRES), one in the 5’ untranslated region and the other one at the beginning of the coding region. The two IRES should enable the synthesis of p53 to occur under stress conditions, such as senescence. The aim of our study was to identify the key elements that control the activity of the two p53 IRES and to study their behavior in senescence. We constructed two dicistronic vectors containing the Renilla luciferase gene (Rluc), which is translated in a classical cap-dependent manner, an intercistronic region containing one of the two IRESs sequences of p53, and the firefly luciferase gene (Fluc), whose translation depends on the IRES in the intercistronic region. The IRES activity was assessed by the ratio between the two luciferase activities (Fluc/Rluc) in cell extracts from HEK293T and primary human fibroblasts. We also inserted a structure preceding the IRES sequence that prevented readthrough or translation reinitiation, which could lead to Fluc synthesis. We verified the absence of cryptic promoter in the two IRES sequences. We also constructed vectors containing the reverse complement region of each of the two p53 IRES (called SERI). We found that the efficiency of translation of Fluc via IRES sequences or via SERI sequences is similar. In addition, the level of Fluc translated via the presumed p53 IRES represents only 1% of the level of Fluc translated in a cap-dependent manner. The activities of so-called IRES of the p53 messenger do not increase in senescent human fibroblasts. Finally, the introduction of a structured region in the 5'UTR of the dicistronic messenger repressed not only the cap-dependent translation of Rluc but also the IRES-dependent translation of Fluc. Our results lead us to conclude that the p53 messenger does not contain any IRES and suggest that the low Fluc activity observed results from a cryptic splicing producing a messenger whose translation generates a portion of Rluc fused to Fluc. Our results are consistent with data reported in the literature showing that the existence of most cellular IRES is disputed. A set of stringent controls must be applied to the study of any presumed IRES before asserting its existence. The two-luciferase reporter, considered as the model of choice for studying IRES-translation, can in fact reveal various abnormalities of gene expression.fr
dcterms.languagefrafr


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