Université de Montréal

Bichemical characterization of a novel halide/bisulfide methyltransferase purified from Brassica oleracea

Par

Jihad Attieh

Département de sciences biologiques

Faculté des arts et des sciences

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures
en vue de l'obtention du grade de
Philosophiæ Doctor (Ph.D.) en sciences biologiques

Octobre 1998

© Jihad Attieh, 1998


Summary

      Biogenic emissions of halomethanes and reduced sulfur gases are important because of the impact of these gases on the global environment; halomethanes affect the integrity of stratospheric ozone and the sulfur gases contribute to the formation of acid precipitation. Although these effects have been well documented, the biosynthetic pathways leading to the formation of these gases are still the subject of much scientific debate. We recently reported that a number of higher plants possessed halide- and bisulfide-methylating enzyme activities, which could be responsible for the emission of monohalomethanes and methanethiol, a reduced sulfur gas. We also presented preliminary evidence that these two activities exist on the same protein in Brassica oleracea. The results reported in this thesis advanced the previous findings through purification of several isoforms of the enzyme to homogeneity, determination of the subcellular localization of the enzyme, studying its substrate specificity, and placing it within a physiological context.

      The enzyme was originally named as S-adenosyl-L-methionine:halide/bisulfide methyltransferase (H/BMT) (EC 2.1.1.-), because it catalyzed the methylation of iodide, bromide, and chloride to the respective monohalomethanes, and of bisulfide to methanethiol. H/BMT was purified from leaves of red cabbage through (NH4)2SO4 precipitation, followed by a combination of conventional and high performance chromatography steps, including gel filtration, affinity chromatography, and anion exchange. Anion exchange chromatography resolved multiple peaks of H/BMT activity suggesting the presence of isoforms, of which the first isoform was initially obtained in homogeneous form. Subsequently, a total of five isoforms of H/BMT were purified to homogeneity from the same tissue using a variation of the above protocol. The proteins had distinct molecular masses, ranging from 26 to 31 kDa, and all functioned as monomers. Characterization of the three most abundant proteins indicated that they had different pH optima, covering the pH range from 5 to 9. Substrate interaction studies for the three isoforms indicated that they shared a sequential substrate binding mechanism. Product inhibition kinetics indicated an Ordered Bi Bi mechanism for substrate binding and product release, with S-adenosyl-L-methionine as the first substrate to bind the enzyme and S-adenosylhomocysteine as the last product to leave. Sulfhydryl-group inhibitors blocked the methylation reaction, suggesting that reduced thiol groups in the enzyme molecule are necessary for activity. H/BMT activity was not detected in chloroplasts, and was not affected by inhibitors of sulfate reduction, showing that the enzyme was not part of the sulfate reduction pathway. Differential centrifugation experiments showed that H/BMT was cytosolic. Substrate specificity of the enzyme was initially examined using a simple assay based on the ability of various compounds to inhibit H/BMT-catalyzed I- methylation. I- methylation was inhibited by a number of thiols, of which thiocyanate ion was the most potent. The aromatic thiols 4,4'-thiobisbenzenethiol, thiophenol, and thiosalicylic acid were also strong inhibitors. High-efficiency methylation of these compounds by completely purified H/BMT was further confirmed using a direct radiometric assay. Each isoform was able to carry out halide, bisulfide and thiol methylations, but none methylated O- or N-substituted equivalents of the thiols. The isoforms had lowest Km values for thiocyanate ion, and slightly higher values for aromatic thiols. Each isoform had distinct Km values for various substrates. A survey of plants showed that H/BMT activity was associated with glucosinolate-containing families. Partial amino acid sequence information from one of the isoforms did not indicate any similarity with known enzymes. However, it had high identity with an Arabidopsis thaliana expressed sequence tag. This EST specifically recognized a 1 Kb transcript only in Northern blots of poly(A+) RNA but not in total RNA from cabbage leaves, suggesting that H/BMT message is low in abundance.

      The results of this study show that halide and bisulfide methylations are indeed catalyzed at the same active site of a single enzyme, H/BMT, but that the natural role of the enzyme is unlikely to be halide methylation. Instead, weight of the evidence indicates that H/BMT is a cytosolic thiol methyltransferase that is probably involved in the detoxification of reactive thiol groups produced upon glucosinolate degradation. The methylation of thiocyanate and of bisulfide by H/BMT strongly suggests that this enzyme is part of the defense machinery in glucosinolate-containing plants. The products of this methylation--methylthiocyanate and methanethiol--are known allelochemicals produced by cabbage.


Résumé

      Notre travail de laboratoire sur l'étude de la biosynthèse des monohalométhanes (CH3X) et du méthyle mercaptan (CH3SH) a débuté suite à la découverte d'une activité enzymatique capable de méthyler les halogénures (X- étant Cl-, Br-, I-) en CH3X (CH3Cl, CH3Br, CH3I) chez quelques algues marines, un champignon, et une plante supérieure halophytique (Wuosmaa and Hager, 1990). L'enzyme, une chlorure méthyle transférase (CMT) utilisant la S-adénosyl-L-méthionine (AdoMet) comme donneur du groupe méthyle, a donc été considérée responsable de la réaction aboutissant à la formation massive des CH3X dans l'environnement (Wuosmaa and Hager, 1990). Les CH3X ont une importance environnementale majeure (Prather and Watson, 1990). Ils jouent, avec les chlorofluorocarbones (CFC), un rôle déterminant dans la chimie de l'atmosphère en affectant l'intégrité de la couche d'ozone stratosphérique. Par exemple, l'émission naturelle de CH3Cl atteint jusqu'à 5 mégatonnes chaque année; cette quantité permet au CH3Cl de parvenir massivement à la stratosphère, malgré sa courte vie atmosphérique de 1,5 années (Harper, 1993). Au niveau de la stratosphère, le CH3Cl exerce une compétition significative contre les CFC, parce qu'il est présent en quantités comparables et même parfois plus grandes que celles des CFC (Lovelock, 1975). Le CH3Cl stratosphérique est détruit par les groupes OH, ainsi que par la photolyse, pour former le monoxyde de chlore et le chlore atomique qui eux sont capables de catalyser la destruction de l'ozone (Prather and Watson, 1990). D'autres CH3X peuvent aussi jouer un rôle similaire dans l'atmosphère (Prather et al., 1984). Plus encore, en catalysant la méthylation du Cl-, la CMT a été considérée comme une enzyme active dans l'élimination de ces ions chez les organismes tolérants au sel (Wuosmaa and Hager, 1990). Une telle propriété de la méthylation des ions Cl- avait déjà été proposée comme outil puissant pour l'amélioration de la résistance des plantes au stress salin (Harper, 1985).

      Afin de déterminer le degré d'implication de cette activité enzymatique dans la tolérance au sel, nous avons examiné 118 plantes supérieures pour leur capacité de méthyler l'I-. L'essai utilisait des disques foliaires, et était basé sur la détéction du CH3I par chromatographie en phase gazeuse (GC) (Saini et al., 1995). Nous avons détecté l'activité méthylant l'I- dans 87 de ces plantes. Cependant, les 21 plantes halophytiques, ou tolérantes au sel, incluses dans notre échantillon, se sont retrouvées dans la partie inférieure du spectre de l'activité de méthylation (Saini et al., 1995). De plus, la salinisation de quelques unes de ces plantes, sous conditions contrôlées, n'a guère changé le profil de l'activité de méthylation par rapport aux plantes non salinisées (contrôles) (Saini et al., 1995). Ces résultats ont indiqué que l'activité méthylant les X- chez les plantes supérieures n'est pas impliquée dans la tolérance au sel. Toutefois, l'activité de méthylation des X- a suivi un patron taxonomique de distribution: les plantes appartenant à l'ordre des Capparales, représenté par plusieurs membres de la famille des Brassicaceae et un membre de la famille des Resedaceae, ont montré les plus hauts taux d'activité (Saini et al., 1995). De plus, toutes les plantes qui ont méthylé l'I- ont aussi méthylé le bisulfure (HS-) pour produire le CH3SH, un membre des composés organiques sulfurés gazeux. Ces derniers, incluant aussi le sulfure de diméthyle (CH3SCH3) et le disulfure de diméthyle (CH3SSCH3), ont reçu une attention particulière suite à la découverte de leurs effets sur la modification du climat, la réduction de la visibilité, et l'acidité des précipitations (Wine et al., 1981).

      Afin d'obtenir une meilleure comprehension de la base biochimique de la synthèse de ces gaz, nous avons purifié partiellement les deux activités de méthylation des X- et du HS-. Nous avons choisi le chou rouge (Brassica oleracea) parce que cette plante est parmi les plus actives dans leur méthylation (Attieh, 1993). Cette purification a impliqué la précipitation des protéines par le (NH4)2SO4, suivie de deux étapes de chromatographie: la filtration sur gel utilisant le Sephadex G-100 et l'affinité utilisant l'adénosine-agarose. Les deux activités de méthylation ont co-purifié dans toutes les étapes de la procédure, et des expériences cinétiques de compétition entre les substrats I- et HS- ont donné des patrons correspondant à une inhibition compétitive mutuelle.(Attieh, 1993). Ces observations ont suggéré que les activités de méthylation des X- et du HS- résident sur la même protéine enzymatique que nous avons appelée halogénure/bisulfure méthyle transférase (H/BMT). Mais, outre la capacité de la H/BMT à méthyler les X- et le HS-, son rôle dans ces deux secteurs différents du métabolisme était complètement obscure. Nous avons donc entrepris le présent travail dans le but de caractériser cette nouvelle activité enzymatique et d'élucider son rôle métabolique chez les plantes supérieures. Les résultats de cette recherche, décrits dans le présent document, montrent que la H/BMT est une thiol méthyle transférase. Cette enzyme semble être impliquée dans la méthylation de produits toxiques de la dégradation des glucosinolates, métabolites secondaires typiques des Brassicaceae et de quelques autres familles végétales.

      La caractérisation de la H/BMT a commencé par sa purification jusqu'à homogénéité. La H/BMT a été purifiée par l'utilisation de deux étapes de chromatographie à haute performance  HPLC  (pour High Performance Liquid Chromatography), en plus des étapes décrites dans une étude précédente (Attieh, 1993). Premièrement, une colonne échangeuse d'anions Protein Pak Q (PP-Q) a séparé l'activité H/BMT en plusieurs pics, dont le premier a été considérablement purifié. Deuxièmement, une filtration sur gel Superdex 75 de ce pic a résulté en une préparation homogène de l'activité H/BMT. Cette préparation contenait une seule protéine de 28 kDa, telle qu'observée sur un gel d'électrophorèse dénaturant à base de sodium dodecyl sulfate (SDS). En tout, cette procédure a mené à une purification supérieure à 1000 fois par rapport à l'extrait brut de la H/BMT. Les profils de purification ont toujours montré la co-purification des activités méthylant I- et HS- dans le même rapport jusqu'à homogénéité. Ensemble, ces données et celles de compétition obtenues auparavant, ont démontré, sans équivoque, que les activités responsables de la production de des CH3X et du CH3SH chez le chou rouge résident au même site actif d'une unique protéine.

      La H/BMT existe en cinq isoformes, comme il a été démontré lors de leur séparation sur la colonne échangeuse d'ions PP-Q. Nous avons aussi purifié ces cinq protéines enzymatiques jusqu'à homogénéité en utilisant une variation de la procédure décrite plus haut. La clé de la réussite de cette purification a été le couplage de deux étapes d'échange d'ions PP-Q, séparées par une étape de filtration sur gel Superdex 75 HiLoad. Cette procédure a enrichi l'activité spécifique des isoformes entre 1600 et 18600 fois par rapport à l'extrait brut. Le patron d'isoformes de la H/BMT ayant pu être le résultat de la dégradation de la même protéine par l'utilisation d'une concentration élevée de (NH4)2SO4 dans la procédure, nous avons vérifié expérimentalement l'existence de ces isoformes. Pour ça, nous avons soumis un extrait brut de chou rouge à une procédure alternative de purification dans laquelle l'étape de précipitation a été supprimée. Le profil d'activité de la H/BMT, suite à l'échange d'ions dans cette procédure, a été similaire à celui de la procédure standard. Ceci a confirmé que les cinq pics montrant une activité H/BMT ne sont pas d'artefacts. Les isoformes de la H/BMT semblent tous être des monomères, leur masse moléculaire à l'état natif et dénaturé se situant entre 26 et 31 kDa. Ceci a été déterminé, respectivement, par filtration sur gel et par électrophorèse sur gel à SDS. Des cinq isoformes, nous avons caractérisé les isoformes II, III, et V comme étant les plus abondants.

      Une préparation de la H/BMT purifiée partiellement a montré des pH optimaux décalés correspondant aux méthylations des X- et du HS-. Pour la formation du CH3I, le pH optimal était entre 5,0 et 7,5, tandis qu'il était de l'ordre de 7,0 à 8,0 pour la formation du CH3SH. Toutefois, cette différence ne signifie pas nécessairement que la H/BMT a des propriétés distinctes pour les X- et le HS-. La différence s'explique plutôt par la diminution de la concentration du substrat HS- due à sa transformation en H2S à un pH inférieur à 7,0 (Crampton, 1974). Par la suite, seul le pH optimal pour la méthylation des X-, dont la concentration n'est pas affectée par les changements de pH, a été déterminé pour les isoformes. L'isoforme II a montré un pH optimal acidique entre 5,2 et 6,4, l'isoforme III a eu un intervalle de pH optimal plutôt large entre 5,8 et 7,8, et l'isoforme V s'est distingué avec un pH optimal strictement alcalin à pH 8,0. Nous avons aussi observé que les inhibiteurs des groupements thiols, tels que l'iodoacétamide, le chloromercuribenzoate et la cystine, ont sévèrement inhibé l'activité de la H/BMT dans les extraits bruts de chou rouge. Ceci signifie que la H/BMT est thiol-dépendante, c'est-à-dire qu'elle possède au moins un groupement thiol qui doit toujours être sous forme réduite pour préserver l'intégrité catalytique de son site actif (Bendall, 1963). Les interactions entre les substrats AdoMet et I- ont donné des régressions linéaires convergentes indiquant un mécanisme séquentiel de fixation des substrats.

      La spécificité de la H/BMT pour les substrats a été examinée rapidement sur un grand nombre de composés en utilisant un essai simple basé sur la capacité de ces composés d'inhiber la méthylation de l'I-. Or, si un composé représente un substrat pour la H/BMT, il devra exercer une compétition contre la méthylation de l'I-, et ainsi inhiber la production du CH3I. Plusieurs composés contenant le groupe thiol (--SH) ont fortement inhibé la méthylation de l'I-. Parmi ceux-ci, le thiocyanate était le plus compétitif, abolissant la méthylation de l'I- à des concentrations jusqu'à vingt fois inférieures à celles de l'I-. D'autres thiols ont aussi fortement inhibé la méthylation de l'I-. Les plus efficaces étaient le 4,4'-thiobisbenzenethiol, le thiophénol, et l'acide thiosalicylique. Afin de nous assurer que ces composés étaient vraiment des substrats pour H/BMT, nous avons développé un essai radiométrique. Dans cet essai, nous avons examiné la capacité de l'enzyme purifiée à transférer un groupe méthyle radioactif (3H-CH3) de l'AdoMet à l'un de ces thiols. Tous les thiols qui avaient inhibé la méthylation de l'I- ont été efficacement méthylés par l'enzyme purifiée, indiquant ainsi que ce sont tous des substrats. Chacun des isoformes qui ont été caractérisés a pu méthyler ces composés. Les constantes cinétiques des isoformes pour ces thiols ont été déterminées. Les isoformes ont eu les plus bas Km pour le thiocyanate (isoforme II, 3,5 µM; isoforme III, 80 nM; isoforme V, 32 nM). Les Km pour les autres thiols étaient aussi bas comparés à ceux pour les halogénures. Ceci a indiqué que l'enzyme n'était probablement pas impliquée dans le métabolisme des halogénures.

      La présence de plusieurs isoformes, les valeurs différentes de leur pH optima, et leurs différentes spécificités pour les mêmes substrats ont tous suggéré que les isoformes de la H/BMT pourraient être localisés dans différents compartiments cellulaires. Toutefois, les chloroplastes étaient dépourvus de cette activité, et des expériences de centrifugation différentielle ont montré que la plupart de l'activité H/BMT était dans le cytoplasme. Lors d'un examen de la présence de l'activité H/BMT chez des plantes de diverses familles, l'activité a été trouvée uniquement chez les membres des familles qui accumulent les métabolites secondaires riches en soufre, les glucosinolates. La séquence interne partielle en acides aminés de l'isoforme V a été obtenue, mais n'avait aucune similarité avec d'autres protéines de fonction connue. Seule la séquence d'un clone provenant d'Arabidopsis thaliana a montré des similarités importantes (85%) avec la séquence de H/BMT, mais ce clone, malgré son expression (EST, pour expressed sequence tag), n'a pas de fonction connue. Celui-ci a été utilisé dans des analyses de Northern, et a spécifiquement reconnu un messager de 1 kb à partir d'ARN poly(A+) de chou rouge.

      Les résultats de cette recherche indiquent que la H/BMT est une thiol méthyle transférase impliquée dans le métabolisme des glucosinolates. Contrairement à nos attentes, elle ne joue probablement pas de rôle significatif dans la production des monohalométhanes à partir d'halogénures. Sous les conditions physiologiques normales, les halogénures ne sont pas disponibles à des concentrations suffisamment élevées pour permettre une méthylation efficace par l'enzyme. La dégradation des glucosinolates produit des composés toxiques, dont le thiocyanate, le HS-, et un nombre important de thiols organiques (Brown and Morra, 1997; Halkier and Du, 1997). Tous ces composés sont utilisés par la plante dans des mécanismes de défense contre l'attaque des herbivores. Toutefois, ces composés peuvent être toxiques pour la plante elle-même et doivent donc être rapidement éliminés. La méthylation est un moyen efficace à cet effet. Le thiocyanate, le HS-, et plusieurs analogues de ces thiols étaient les meilleurs substrats pour H/BMT, tandis que les thiols biologiques, comme la methionine, la cystéine, et la glutathione n'ont pas été méthylées. Ces résultats étaient en accord avec le rôle de la H/BMT dans l'élimination de composés toxiques produits durant le métabolisme cellulaire. D'autre part, les produits de méthylation du thiocyanate et du HS-, le méthyle thiocyanate et le CH3SH, sont des agents allélopathiques. Les résultats du présent travail suggèrent fortement que la H/BMT est responsable de leur biosynthèse, et ainsi, cette nouvelle enzyme serait impliquée dans la réaction de défense chez les familles de plantes riches en glucosinolates.


List Of Abbreviations

AdoMet:
S-adenosyl-L-methionine
AdoHcy:
S-adenosylhomocystenie
AP:
Alkaline phosphatase
APS:
Adenosine 5'-phosphosulfate
BCIP:
5-bromo-4-chloro-indolyl-phosphate
BSA:
Bovine serum albumin
Cat:
Catalase
CCN:
Cloud condensation nuclei
CCR:
Cytochrome C reductase
CFC:
Chlorofluorocarbons
CIP:
Calf intestinal phosphatase
DCPIP:
2,6-dichlorophenolindophenol
DMSP:
Dimethylsulfoniopropionate
EST:
Expressed sequence tag
GC:
Gas chromatography
GMP:
Glucose mycological peptone
H/BMT:
Halide/bisulfide methyltransferase
HEPES:
N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid
HMT:
Halide methyltransferase
HPLC:
High performance liquid chromatography
HRP:
Horseradish peroxidase
Kav:
Partition coefficient
kb:
Kilobase
kDa:
Kilodalton
Km:
Michaelis-Menten constant
MALDI-MS:
matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry
MCT:
Methyl chloride transferase
MMPA:
3-methiolpropionate
MOPS:
3-[morpholino]propanesulfonic acid
MSA:
Methanesulfonic acid
NBT:
Nitroblue tetrazolium chloride
PAGE:
Polyacrylamide gel electrophoresis
PAPS:
3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate
PMS:
phenasine methosulfate
ppb:
Parts per billion
ppm:
Parts per million
PP-Q:
Protein Pak Q
PVDF:
Polyvinylidene difluoride
PVP:
Polyvinylpyrrolidone
PVPP:
Polyvinylpolypyrrolidone
RUDP:
Ribulose 1,5-diphosphate
SDH:
Succinate dehydrogenase
SDS:
Sodium dodecyl sulfate
SMM:
S-methylmethionine
TBS:
Tris-buffered saline
TEMED:
N,N,N',N'-tetramethyl-ethylenediamine
TPI:
Triose phosphate isomerase
UDPG:
Uridine-diphospho-glucose

Remerciements

      Je voudrais, en tout premier lieu, remercier mon directeur de thèse, Dr. Hargurdeep S. Saini, pour m'avoir accueilli dans son laboratoire et pour m'avoir enseigné tout ce que je sais de la physiologie végétale. Son enthousiasme pour la recherche, son ouverture d'esprit et son appui constant, m'ont créé un environnement idéal pour accomplir ce travail. Je suis très reconnaissant pour sa disponibilité illimitée ainsi que pour m'avoir vraiment appris la rédaction scientifique, une tâche non négligeable en recherche. Je le remercie pour son support financier, sans quoi je n'aurais pas eu la chance de m'aventurer dans ce périple qu'est la science. Mais ce que j'apprécie surtout c'est la confiance qu'il m'a accordée et qui a pu chercher le meilleur en moi, surtout dans les moments difficiles tant au laboratoire en travaillant, qu'au Jardin en courant! Les paroles me trahissent, mais si je peux finir en quelques mots, je dirai: Deep, je ne te remercierai jamais assez.

      Mes remerciments sont aussi des plus profonds à l'endroit du Dr. Andrew D. Hanson qui a continué à susciter en moi l'intérêt d'aller chercher le meilleur. Malgré son absence de l'IRBV, Dr. Hanson a été disponible pour répondre à mes questions, et a toujours fourni les conseils les plus constructifs.

      Durant les années de mes études, j'ai eu la chance de rencontrer plusieurs personnes à l'IRBV. Faute de pouvoir toutes les mentionner, je remercie chacune qui, de près ou de loin, a contribué à ce que mon séjour à l'IRBV ait été aussi agréable. Parmi ces personnes, je m'en voudrais de ne pas mentionner les suivantes: Dr. Vincenzo De Luca, Dr. David Morse, Dr. Mario Cappadocia, Dr. Daniel Matton, Dr. Dwight Beebe, Dr. Luc Brouillet et Dr. J.-André Fortin. Leurs conseils précieux, leur coopération de me permettre d'utiliser leur équipement de laboratoire, et nos discussions enrichissantes m'ont aidé à sortir le meilleur de mon projet et à développer l'esprit critique, nécessaire dans ce domaine.

      Je tiens aussi à exprimer ma gratitude aux Dr. Salvatore Sparace, Dr. Rajinder Dhindsa et Dr. Fathey Sarhan. Leur contribution à ma formation, en tant que membres de jury sur mes examens, ou en tant que collaborateurs, fût des plus appréciées.

      Je remercie tous les collègues qui sont passés par le 302, mais surtout Dr. Kathryn Kleppinger-Sparace, pour son aide technique et son support moral. Dr. Inder Sheoran, pour m'avoir appris la patience, et pour avoir été si généreux avec ses conseils. Son amitié est une fierté pour moi. Joginder Singh, pour son sens de l'humour et sa complicité, je n'oublirai jamais notre temps ensemble. Dr. Sylvie Lalonde, pour sa grande disponibilité et son aide. Un merci du fond du coeur à mes collègues actuels du 302: Dr. Deepti Saxena, pour être si chaleureuse et compréhensive. Chantale Nunes, pour sa présence, ses encouragements, sa confiance en moi et son amitié, cette amitié m'est des plus chères. Tai Sup Yoon, pour sa gentillesse et sa confiance. Il me faut aussi mentionner des collègues et membres de l'IRBV qui m'ont aidé durant mes études: Edith Morin, Denis Lauzer, Sylvain Rivard, Felipe Vazquez Flota, Dr. Benoit St-Pierre, Pierre Laflamme.

      Il n'y a pas que les collègues à l'IRBV, nombreuses sont les personnes dont le travail soigné facilite notre vie à l'IRBV: Mme Nicole Taillefer, pour sa gentillesse, son efficacité et sa coopération illimitée, je lui serai reconnaîssant pour toujours. M. Claude Lafleur, pour sa disponibilité et son savoir faire, mais surtout pour avoir été si aimable. Mme Lucie Campeau, pour sa politesse, son aide et son sens de l'humour. Mme Loraine Lambert, pour son assistance continue et son enthousiasme. Mme Diane Denis, pour sa coopération lors de nos commandes toujours «urgentes». M. Sylvain Lebeurier, pour son aide indispensable et ses soins impeccables de nos plantes.

      Je tiens à remericer le Fonds pour la Formation des Chercheurs et l'Aide à la Recherche du Gouvernement du Québec ainsi que la Faculté des études supérieures et le Département de sciences biologiques de l'Université de Montréal pour les bourses que j'ai obtenues durant la plupart de mes études doctorales. Je voudrais aussi remercier le fonds de bourses de l'IRBV et de l'American Society of Plant Physiologists qui m'ont permis d'assister à plusieurs congrès scientifiques nationaux et internationaux.

      Rien de ça n'aurait pu se faire sans mes parents. Malgré la grande distance qui nous a séparés, ils sont toujours restés avec moi, me guidant par leur prières et me rassurant par leur confiance sans bornes. Papa, ta persévérance m'a servi d'exemple dans les moments difficiles. Maman, ton amour m'a éclairé le chemin dans les périodes sombres. Un grand merci à mon frère Ziad, mes soeurs Jihane et son mari Edouard, Rosine et Racha parce que vous êtes là. J'ai été très chanceux d'être né parmi vous. Je me considère aussi chanceux d'avoir été entouré par une belle-famille qui m'a pris comme un fils. Je pense surtout à ma belle-mère Nadia qui n'a pas hésité un instant de sacrifier son temps pour venir nous aider et nous rendre la vie facile. Je pense aussi à Charles et Carole, Zouheir et Anna, Hanna et Randa qui, par leur présence et leurs encouragements, m'ont été des frères et des soeurs durant toutes ces années. Ici, je ne peux que penser à mon beau-père, Souheil, que je n'ai pas pu connaître. Je ne serai jamais capable de le remercier pour le cadeau qu'il m'a offert sans le savoir. Je sais qu'il est fier d'Amal et de moi.

      Un grand merci s'impose à mes deux tout petits, Nicolas-Melhem et Michel. Vous êtes la cause de ma joie, la raison de ma vie. Vous me faites respirer, vivre, rire et rester jeune. Voici le fruit des nuits que Papa a passées à «l'Université», il vous appartient.

      Quoi dire enfin à Amal? Un merci n'est rien qu'une goutte dans la mer des sacrifices que tu as faits pour moi. Tu as su rendre ma vie agréable lorsqu'elle semblait amère. Tu t'es occupée seule de Nicolas et Michel, quand il fallait que je sois présent. Tu m'as compris sans que je te dise un mot aux moments où je pensais que personne ne me comprenait peu importe combien j'expliquais. J'espère pouvoir un jour te remercier pour ton support constant, pour les longues heures passées seule, pour ta compréhension inégalée, enfin pour tout.


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