Expression of steroidogenic proteins and genes in bovine placenta from conventional and somatic cell nuclear transfer (SCNT) gestations

Abstract

Pendant la grossesse, les hormones stéroïdes jouent un rôle indispensable dans la régulation des principales manifestations physiologiques telles que la reconnaissance maternelle de la gestation, la réceptivité de l'endomètre, le début du développement embryonnaire ainsi que le maintien de la gestation. Cependant, on sait très peu sur la production de ces hormones et les principaux facteurs des voies intracellulaires impliqués dans le processus de stéroïdogenèse dans le placenta bovin pendant les stades initiaux et plus avancés de la gestation. Par ailleurs, certaines anomalies du placenta chez les bovins suite à une mauvaise production de stéroïdes n'ont pas encore été démontrées. Les objectifs de cette thèse étaient donc de : 1) déterminer la présence et la localisation des principales protéines stéroïdiennes dans le placenta de bovins provenant de gestations de 50 à 120 jours, 2) comparer l'expression placentaire d'une série de gènes et de protéines stéroïdiennes entre une gestation impliquant un transfert de noyaux de cellules somatiques (SCNT) et une gestation non-clonale; 3) étudier l'impact des hormones trophiques et des seconds messagers sur la stéroïdogenèse dans le placenta bovin à 140 +10 jours de gestation. L’utilisation de techniques d’immunohistochimie, d’immunobuvardage et de PCR quantitatif nous a permis d’évaluer la présence d'un large éventail de gènes stéroïdiens (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 et SCARB1) qui participent au transport du cholestérol et dans la production de différents types de stéroïdes. Dans cette thèse, nous avons démontré la capacité du placenta bovin d’initier la stéroïdogenèse au début de la gestation et nous avons également déterminé les principales cellules impliquées dans ce processus. Nous avons constaté que les tissus maternels expriment les principaux marqueurs de stéroïdogenèse suggérant une plus grande capacité stéroïdogénique que les tissus fœtaux. En outre, un modèle d'expression des protéines complémentaires stéroïdogéniques entre la caroncule et le cotylédon a été observé, indiquant que la stéroïdogenèse placentaire exige une communication cellule à cellule entre les cellules de la mère et du fœtus. Après avoir démontré les principales cellules impliquées dans la synthèse des hormones stéroïdiennes dans le placenta bovin en début de gestation, nous avons ensuite étudié les modifications possibles de la stéroïdogenèse dans les tissus SCNT cotylédonaires à 40 jours de gestation. Nous avons identifié d'importantes modifications dans l'expression des gènes STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, et SULT1E1. Conséquemment, nous postulons que l'expression réduite des gènes stéroïdiens peut provoquer une insuffisance de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes, ce qui pourrait contribuer à un développement anormal du placenta et du fœtus dans les gestations SCNT à court ou long terme. Finalement, nous avons développé un modèle efficace de culture d’explants de placentome qui nous a permis d'explorer les mécanismes sous-jacents spécifiques à la stéroïdogenèse placentaire. Nous avons exploré l'effet stimulant des hormones trophiques et différents messagers secondaires sur l'expression de différentes protéines stéroïdogéniques ainsi que le taux de progestérone (P4) dans les explants de placentome. En utilisant les techniques de RIA et de PCR quantitatif, nous avons constaté que même si les analogues de l'hormone lutéinisante (hCG) ont un effet stimulant sur plusieurs gènes stéroïdiens, le calcium ionophore est le principal modulateur dans la synthèse de la P4. Ces résultats suggèrent que dans le placenta bovin, la synthèse de la P4 est modulée principalement par l'afflux de calcium intracellulaire, et apparemment les nucléotides cycliques ne semblent pas contrôler ce processus. En conclusion, cette étude contribue de manière significative à une meilleure compréhension des mécanismes d'entraînement de la synthèse des stéroïdes placentaires au début de la gestation et permet aussi d’apporter de nouveaux éclairages sur l'importance des stéroïdes placentaires dans la régulation du développement du placenta et du fœtus.

During pregnancy, steroid hormones have essential roles in regulating key physiological events such as maternal recognition, endometrial receptivity, early embryonic development, and maintenance of pregnancy. However, very little is known about the production of these hormones nor about the principal factors and intracellular pathways implicated in the steroidogenic process in bovine placenta, during early and advanced pregnancy. In addition, placental abnormalities in cattle following an improper steroid production in bovine placenta have not been yet demonstrated. The aims of this thesis were to: 1) determine the occurrence and localization of the principal steroidogenic proteins in bovine placenta from day 50 to day 120 of pregnancy; 2) compare the placental expression of a series of steroidogenic genes and proteins between somatic cell nuclear transfer (SCNT) pregnancies and non-SCNT gestations; 3) investigate the impact of trophic hormone, and second messengers on steroidogenesis in bovine placenta at 140 +10 days of gestation. Using immunohistochemistry, western blot and qPCR techniques, we evaluated the presence of a wide range of steroidogenic genes (STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SCARB1), that participate in the cholesterol transport and in the production of different types of steroids. In this thesis, we demonstrated the capability of the early bovine placenta to initiate steroidogenesis, and we also determined the principal cells implicated in this process. We found that maternal tissue expresses the principal steroidogenic markers suggesting it has a greater steroidogenic capacity compared to fetal tissue. Moreover, a complementary pattern of steroidogenic protein expression between the caruncle and the cotyledon were found, indicating that placental steroidogenesis requires cell to cell communication between the maternal and fetal cells. Having shown the principal cells involved in the synthesis of steroid hormones in bovine placenta during early pregnancies, we then studied possible alterations in steroidogenesis in cotyledonary tissue in SCNT at 40 days of pregnancy. We identified significant alterations in the expression of STAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1 and SULT1E1 transcripts. Therefore, we postulate that reduced expression of steroidogenic genes may cause an insufficient local biosynthesis of steroid hormones, which might contribute to the abnormal placental and fetal development in SCNT gestations at short or long term. Finally, we developed an efficient placentome explants culture model that allowed us to explore the specific mechanisms underlying placental steroidogenesis. We explored the stimulatory effect of trophic hormones and different second messengers on the expression of various steroidogenic proteins and the progesterone levels in placentome explants. By RIA and qPCR techniques, we found that although LH-like hormones (hCG), had a stimulatory effect on multiple steroidogenic genes, the calcium ionophore was the principal modulator in the synthesis of progesterone. These results suggest that in bovine placenta, the synthesis of progesterone is modulated principally by intracellular calcium influx, and cyclic nucleotides do not seem to be controlling this process. In conclusion, these studies significantly contribute to a better understanding of the driving mechanisms of placental steroid synthesis in early gestations and also provide new insights into the importance of placental steroids in the regulation of placental and fetal development.