Développement d’un microréacteur à base d’enzyme microencapsulée en vue d’un couplage en ligne à un système d’électrophorèse capillaire

Abstract

L’objectif principal de ce projet de recherche est d’étudier l’efficacité de la microencapsulation, technique d’immobilisation d’enzymes utilisée pour la réalisation des nouveaux biocapteurs électrochimiques. Généralement, l’analyte d’intérêt produit ou consomme des électrons, et la réponse électrochimique est mesurée, afin d’identifier ou quantifier l’analyte. Dans le développement d’un biocapteur, il est désirable de quantifier la conversion du substrat (analyte) et/ou la formation de produit de réaction enzymatique. Les similarités structurales entre le substrat et le produit de réaction dans les réactions redox demandent que la technique utilisée pour les identifier soit très sélective. Le haut pouvoir de résolution de l’électrophorèse capillaire (EC) pour des séparations rapides de produits similaires en fait une méthode de choix, spécialement quand le substrat et le produit peuvent être suivis pendant et après la réaction catalysée par l’enzyme immobilisée. Un choix judicieux du substrat, compte tenu de son comportement en EC peut fournir des informations autant sur l’activité de l’enzyme que sur l’efficacité de la microencapsulation. Pour cette raison, nous avons choisi le substrat o-phenylènediamine qui est oxydé par la laccase, pour former le produit 2,3-diaminophenazine, tout en réduisant l’oxygène en eau. Pour commencer, nous avons préparé les microcapsules et évalué l’impact de la microencapsulation sur le comportement de l’enzyme. Ensuite, nous avons développé une méthode de séparation en EC afin de quantifier la conversion de l’OPD en DAP par la laccase libre. La même méthode d’analyse a été utilisée pour caractériser la laccase immobilisée dans les microcapsules. Par la suite, afin de suivre la réaction enzymatique, un microréacteur à base d’enzyme microencapsulée a été couplé hors ligne au système d’EC. Finalement, nous avons essayé l’implémentation du système en ligne et les résultats préliminaires seront présentés.

The principal objective of this research project is to study the efficiency of microencapsulation, technique used for enzyme immobilization in order to create new types of electrochemical biosensors. Generally, the target analyte involved either produces or consumes electrons and the electrochemical response is measured to identify or quantify the analyte. In the development of a biosensor, it is desirable to quantify the conversion of substrate (analyte) and/or the formation of product of the enzymatic reaction. The structural similarity between substrate and product in redox reactions means that the technique used to determine these species must be very selective. The high resolving power of capillary electrophoresis (CE) for rapidly separating similar compounds is thus an attractive method, particularly if substrate and product can both be monitored during or following the reaction catalyzed by microencapsulated enzyme. A judicious choice of substrate with respect to its behaviour in CE separations can help provide information on enzyme activity as well as microencapsulation efficiency. To achieve this, we chose the substrate o-phenylenediamine (OPD), which is oxidized by laccase to form the product 2,3-diaminophenazine (DAP) concomitant with the reduction of molecular oxygen to water. We firstly prepared the microcapsules and evaluate the impact of microencapsulation on the behaviour of the enzyme. After that, we developed a CE based separation method to quantify the conversion of OPD to DAP by free laccase. We also used the CE method to characterize laccase immobilized in microcapsules. Subsequent, the microencapsulated laccase was packed into a microreactor format permitting its off-line coupling with CE as a means to follow the enzymatic reaction. Finally, we tried to implement the on-line system and the preliminaries results are presented.