Conception de miARN artificiels basée sur la caractérisation de la boucle de régulation miR-20/E2F

Abstract

La biologie moléculaire et, plus spécifiquement, la régulation de l’expression génique ont été révolutionnées par la découverte des microARN (miARN). Ces petits ARN d’une vingtaine de nucléotides sont impliqués dans la majorité des processus cellulaires et leur expression est dérégulée dans plusieurs maladies, comme le cancer. Un miARN reconnaît ses cibles principalement par son noyau, ce qui lui permet de réguler simultanément la traduction de centaines d’ARN messagers. Nos travaux ont montré l’existence d’une boucle de rétro-activation négative, entre deux miARN du polycistron miR-17-92 et trois facteurs de transcription de la famille E2F. E2F1, 2 et 3 induisent la transcription de miR-20 et miR-17 qui par la suite inhibent leur traduction. Nos résultats suggèrent l’implication de cette boucle dans la résistance à l’apoptose induite par E2F1 dans les cellules du cancer de la prostate, ce qui expliquerait en partie le potentiel oncogénique du polycistron miR-17-92. L’étude de ce motif de régulation nous a donc permis de réaliser le potentiel incroyable qu’ont les miARN à inhiber la traduction de plusieurs gènes. Basé sur les règles de reconnaissance des miARN, nous avons développé et validé MultiTar. Cet outil bioinformatique permet de trouver la séquence d’un miARN artificiel ayant le potentiel d’inhiber la traduction de gènes d’intérêts choisis par l’utilisateur. Afin de valider MultiTar, nous avons généré des multitargets pouvant inhiber l’expression des trois E2F, ce qui nous a permis de comparer leur efficacité à celle de miR-20. Nos miARN artificiels ont la capacité d’inhiber la traduction des E2F et de neutraliser leur fonction redondante de la progression du cycle cellulaire de façon similaire ou supérieur à miR-20. La fonctionnalité de notre programme, ouvre la voie à une stratégie flexible pouvant cibler le caractère multigénique de différents processus cellulaires ou maladies complexes, tel que le cancer. L’utilisation de miARN artificiels pourrait donc représenter une alternative intéressante aux stratégies déjà existantes, qui sont limitées à inhiber des cibles uniques. En plus d’élucider un réseau de régulation complexe impliquant les miARN, nous avons pu tirer profit de leur potentiel d’inhibition par la conception de miARN artificiels.

miRNAs are powerful regulators of gene expression in mammals. These small RNAs of around 20 nucleotides are involved in several cellular processes and diseases. MiRNAs recognize their targets mainly by a region comprising nucleotides 2-8, known as the seed. This characteristic gives them the potential to inhibit hundreds of messenger RNAs. Our first goal was to better characterize the complex network involving miRNAs in the regulation of gene expression. To achieve this, we studied the relation between a family of transcription factors, the E2Fs, and a family of miRNAs, the miR-17-92 cluster. Our results suggest a negative feedback loop involving miR-17, miR-20a, E2F1, E2F2 and E2F3. In this loop E2F1, 2 and 3 activate the transcription of the two miRNAs that inhibit their translation in return. The inhibition of the antiapoptotic function of E2F1 by miR-17 and miR-20 in a prostate cancer context, could explain the oncogenic potential of the miR-17-92 cluster that was previously reported. Studying the miR-20/E2F feedback loop made us realize how powerful was the ability of miRNAs to inhibit several targets. To overcome the lack of efficient tools able to inhibit simultaneously the expression of multiple genes, our second goal was to develop MultiTar, an algorithm able to design artificial miRNAs that target a set of predetermined genes. MultiTar was validated in silico, using known targets of endogenous miRNAs and in vivo, taking advantage of our experience with the E2F context. We designed artificial miRNAs against E2F1-3 and expressed them both in normal human fibroblasts and prostate cancer cells where they inhibited cell proliferation and induced cellular senescence. The observed phenotypes were precisely those known for inhibiting E2F activities. Hence, MultiTar can efficiently design artificial micro RNAs able to target multiple genes and is thus a flexible tool that can address the issue of multigenic diseases and complex cellular processes. The use of multitargets could be an alternative to overcome the limits of drugs or siRNAs that are designed generally to regulate only one target.