Caractérisation phénotypique et génotypique d’isolats de Salmonella Typhimurium provenant de porcs sains ou septicémiques

Abstract

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence.

L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains.

Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés.

Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées.

Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection.

Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc.

Salmonella Typhimurium infections represent an important threat both to the swine industry and public health since pig is also a reservoir for human infections. Multiresistance to antimicrobial agents is often associated with S. Typhimurium belonging to phage type (PT) 104, and these isolates can cause septicemia in fattening pigs. It is thus necessary to control the infection at the herd level to avoid meat contamination by these isolates. However, in order to develop more efficacious control measures, it is important to characterize isolates, better understand the pathogenesis of infection and identify virulence factors.

The main objective of this study was to characterize isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine and to compare them to isolates recovered from healthy pigs.

Isolates of S. Typhimurium associated with septicemia in swine (CS) were compared to isolates recovered from healthy animals at slaughterhouses (WCS). The phage type of each isolate was identified and these isolates were characterized by antimicrobial resistance, SDS-PAGE and immunoblotting, and PFGE. Among the CS isolates, PT 104 represented 36.4% of isolates while it represented 51.5% of WCS isolates. Resistance to as many as twelve antimicrobial agents was found in isolates from CS and WCS. However, it was not possible to associate any particular protein to septicemic isolates. Multiple genetic profiles were identified among the isolates of PT 104.

Different steps of the pathogenesis of Salmonella infection were evaluated, in particularly the ability to adhere to and invade intestinal epithelial cell lines by CS and WCS isolates. The isolates recovered from diseased animals invaded intestinal epithelial cell lines at a higher rate than isolates from healthy pigs (P=0.003). Some isolates were selected according to their invasion rate and some analysis, using flow cytometry were done to evaluate phagocytosis, induction of apoptosis, and adhesion to intestinal mucus. The survival in monocytes was evaluated and the MATS method was used to evaluate the bacterial surface properties, measuring interactions with solvents. Isolates from WCS were more phagocytized than isolates fom CS at 15 minutes (P=0.02). We found no significant difference for the other methods used.

Using SSH, we also compared the genome of a CS isolate (#36) to that of a WCS isolate (#1), for the identification of putative virulence factors. Clones with chromosome and plasmids homology were obtained. It was therefore decided to analyze the plasmid profiles of all isolates. Two profiles (PL14 and PL20) were more frequently observed in the PT 104 isolates than in the isolates belonging to other phage types (P=0.01 and P=0.01, respectively). Various profiles were found in both isolates from septicemic pigs and those from healthy pigs. An interesting plasmid of the CS isolate was sequenced. This plasmid possesses genetic information for replication as well as a beta-galactosidase-α. It would be needed to characterize the role of these putative virulence factors in the future.

Our work suggests that isolates from septicemic pigs may be distinguished from isolates from healthy pigs by their better ability to invade intestinal cells as well as by a lower rate of phagocytosis in the early steps of infection. This study increased our knowledge on the pathogeny of S. Typhimurium infection in pigs.