Impact d’une mutation ponctuelle stratégique de la protéine HOXB4 sur son pouvoir de régulation, de prolifération et de différenciation des CSH et des progéniteurs murins

Abstract

L’expansion des cellules souches hématopoïétiques ex vivo représente une option des plus intéressante afin d’améliorer les greffes de moelle osseuse. Le facteur de transcription HOXB4 semble être le candidat ayant le plus de potentiel jusqu’à présent. Cependant, la très courte demi-vie de la protéine représente un obstacle majeur dans l’élaboration de protocoles cliniques. Par contre, la substitution d’un acide aminé (3 mutations individuelles) dans la partie N-terminale de la protéine augmente de près de 3 fois la stabilité intracellulaire de HOXB4. Nous avons comparé l’activité biologique de ces mutants à celle de HOXB4 natif (« wt ») dans des essais in vitro et in vivo. Nous avons démontré que la surexpression de HOXB4 muté par infection des cellules souches hématopoïétiques n’affectait pas leur pouvoir de reconstitution hématopoïétique à long terme dans des souris transplantées. Par ailleurs, nous avons noté que dans les essais de reconstitution hématopoïétique en compétition et en non compétition, les cellules surexprimant les protéines mutées ont une expansion supérieure in vitro et reconstituent le sang et la rate avec une répartition de cellules lymphoïdes et myéloïdes plus près de souris non-transplantées comparativement aux cellules exprimant HOXB4 « wt ». De plus, les cellules surexprimant la protéine HOXB4 mutée apparaissent beaucoup plus rapidement et en plus grande proportion dans le sang comparativement aux cellules surexprimant la forme native. Une des protéines HOXB4 mutées (1426) ne permet pas l’expansion des progéniteurs myéloïdes immatures (CMP) contrairement à la protéine « wt ». Et finalement, par les études de modulation intracellulaire protéique, nous avons démontré que les comportements des protéines HOXB4 « wt » et mutées envers les cellules souches hématopoïétiques et progéniteurs n’étaient pas complètement dus à un effet de concentration protéique.

Ex vivo hematopoietic stem cell expansion represents a most appealing option to improve bone marrow transplantation. Utilization of the unique hematopoietic stem cell (HSC) expansion abilities of the transcription factor HOXB4 for clinical applications is hampered by its short intracellular half-life. To overcome this difficulty, 3 different single amino-acid substitution mutants of HOXB4 with 3-4 fold increased half-life were generated and their biologic activity compared to that of wild type (wt) HOXB4 using in vitro and in vivo assays. We have shown that overexpression of mutated HOXB4 in HSC using an infection strategy did not impair their long term hematopoietic reconstitution potential in transplanted mice. We have found that cells overexpressing mutant HOXB4 had greater expansion in vitro in competitive and non-competitive designs than wt HOXB4. Moreover, in vivo peripheral blood and spleen repopulation had lymphoid and myeloid contributions closer to untransplanted animals with mutant than wt HOXB4. In addition, cells overexpressing mutant HOXB4 protein were detected much more rapidly and in greater proportion in peripheral blood than cells overexpressing the wt form. One of the mutated HOXB4 proteins (1426) did not promote the expansion of common myeloid progenitors in comparison to wt HOXB4. Finally, using intracellular protein modulation studies, we have shown that the effects of mutated and wt HOXB4 proteins in hematopoietic stem and progenitor cells were not completely due to a HOXB4 concentration effect.