La fibrose en deux parties : de la paillasse à la souris

Abstract

L’apoptose des cellules endothéliales (CE) représente un évènement initial dans le développement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique d’allogreffe et la sclérose systémique. Nous avons démontré que les médiateurs issus des CE apoptotiques entraîne la différenciation myofibroblastique et la résistance à l’apoptose, deux mécanismes centraux à la fibrogénèse. L’activation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractérise ces deux mécanismes. Un fragment C-terminal du perlécan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe l’apoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail étaient de : 1. définir les récepteurs et la signalisation impliqués dans la réponse anti-apoptotique et 2. caractériser les médiateurs fibrogéniques responsables de la différenciation myofibroblastique.

En ce qui a trait à la réponse anti-apoptotique, l’inhibition des intégrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prévient la résistance à l’apoptose et la phosphorylation d’Akt normalement induites par le milieu conditionné par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces résultats suggèrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un état de résistance à l’apoptose chez les fibroblastes par des voies α2β1integrines/SFK/PI3K dépendantes. Le LG3 n’induit cependant pas la différenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractérisé le milieu SSC de façon à identifier les médiateurs responsables de la différenciation myofibroblastique.

Les milieux conditionnés par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont été analysés comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectrométrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrogénique connu augmenté dans le milieu SSC. L’inhibition de la caspase-3 chez les CE prévient la relâche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, l’inhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prévient la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. L’anticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) n’est pas en mesure de bloquer la différenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanées de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entraîne une augmentation de l’épaisseur de la peau et des niveaux protéiques d’SMA, de vimentine et de collagène I. Cette réponse fibrogénique est réduite chez les souris qui ont reçu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodéplété de son CTGF.

Ces résultats apportent de nouvelles issues mécanistiques au niveau de la réponse fibrogénique activée par la mort des CE. L’activation des caspases chez les CE apoptotiques entraîne la production de LG3 et de CTGF qui, à leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dépendantes chez les fibroblastes, et ce indépendamment du TGF-.

Apoptosis of endothelial cells (EC) is an early event in various fibrotic diseases including chronic allograft vasculopathy and systemic sclerosis. We showed previously that mediators released by apoptotic EC activate myofibroblast differentiation and resistance to apoptosis, two mechanisms pivotal to fibrogenesis. PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) activation was found to be central to these two mechanisms. A C-terminal fragment of perlecan (LG3) produced by apoptotic EC was found to inhibit apoptosis of fibroblasts. The aims of the present project were : 1. to define the receptors and pathways implicated in this anti-apoptotic response and 2. to characterize the fibrogenic mediators implicated in myofibroblast differentiation.

Concerning the anti-apoptotic response, the inhibition of 21 integrin activity in fibroblasts exposed to either medium conditioned by apoptotic EC (SSC) or LG3 prevented resistance to apoptosis and was associated with decreased levels of Akt phosphorylation. Neutralizing Src family kinases (SFK) activity in fibroblasts produced the same effects. These results suggest that LG3 produced by apoptotic EC initiate a state of resistance to apoptosis in fibroblasts via an α2β1integrin/SFK/PI3K dependent pathway. LG3 did not induce myofibroblast differentiation. We went on to identify which mediators present in SSC are implicated in myofibroblast differentiation.

Media conditioned by apoptotic and non-apoptotic EC (respectively SSC and SSC-ZVAD) were analyzed comparatively by 2-dimension liquid chromatography, western blotting and mass spectrometry. Connective tissue growth factor (CTGF) was the only known fibrogenic factor increased in SSC. Caspase-3 silencing of EC demonstrated that CTGF is released by apoptotic EC downstream of caspase-3 activation. In fibroblasts, blocking the activation of SFK or silencing the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) blocked myofibroblast differentiation triggered by either SSC or recombinant CTGF in vitro. Exposure to a pan-transforming growth factor (TGF-β) neutralizing antibody failed to attenuate myofibroblast differentiation in fibroblasts exposed to either SSC or CTGF. Subcutaneous injection of mouse SSC to C3H mice daily for three weeks led to increased skin thickness, increased protein levels of αSMA, vimentin and collagen I. This fibrogenic response was blunted in mice injected with either SSC-ZVAD or SSC immunodepleted of CTGF.

These results bring new mechanistic insights into the fibrogenic pathways activated by EC death. Caspase activation in apoptotic EC triggers the production of LG3 and CTGF which in turn activate SFK/PI3K dependant pathways in fibroblasts thus activating a TGF-β-independent fibrogenic response.