Analyse structurale du pilus du système de sécrétion type IV chez Agrobacterium tumefaciens et Escherichia coli
Thesis or Dissertation
2022-05 (degree granted: 2022-11-24)
Author(s)
Advisor(s)
Level
DoctoralDiscipline
BiochimieKeywords
- Plasmides conjugatifs
- conjugaison
- système de sécrétion de type IV
- résistance aux antibiotiques
- pilus
- pKM101
- phospholipides
- protéines de type VirB2
- protéines de type VirB5
- interaction protéine-protéine
- Conjugative plasmids
- conjugation
- type IV secretion system
- antibiotic resistance
- phospholipids
- VirB2-like proteins
- VirB5-like proteins
- protein-protein interaction
- Biochemistry / Biochimie (UMI : 0487)
Abstract(s)
Le succès des antibiotiques à combattre les bactéries pathogènes a rendu leur utilisation excessive et sans control dans plusieurs domaines, surtout dans l’agriculture et l’élevage des animaux, ce qui a favorisé l’apparition des gènes de résistance aux antibiotiques. Les bactéries résistantes aux antibiotiques représentent actuellement un problème majeur pour la santé publique et pour l’économie mondiales. Les bactéries peuvent échanger ou bien acquérir ces gènes de résistance par l’intermédiaire d’un système de sécrétion nommé type IV (T4SS). Chez les bactéries à Gram-négatif, le T4SS est composé de 12 protéines (VirB1 jusqu’à VirB11, et VirD4) qui forment un canal de translocation transmembranaire, une structure filamenteuse extracellulaire appelé pilus, et les ATPases.
Nous avons utilisé la microscopie cryo-électronique pour étudier le pilus du T4SS chez le pathogène des plantes Agrobacterium tumefaciens (pilus-T) et chez Escherichia coli provenant du plasmide conjugatif pKM101 (pilus-N). Les structures à haute résolution obtenues des pili -T et -N (3.2 Å et 3 Å respectivement) montrent qu’ils sont formés d’un assemblage sous forme hélicoïdale du complexe piline/phospholipide en une stœchiométrie de 1:1. Le lumen des pili -T et -N contient un acide aminé chargés positivement et la mutation de cet acide aminé chez A. tumefaciens (Arg91) entraine une déstabilisation de la protéine et une perte de formation du pilus. La tête des phospholipides est exposée au lumen du pilus et nos résultats ont montré un effet des phospholipides sur la charge globale de l’intérieur du pilus, ce qui influence probablement le fonctionnement du pilus lors du transfert du substrat.
Le pilus est composé de la protéine piline VirB2 qui représente le composant majeure, et de la protéine VirB5 qui entrent dans la composition du pilus et qui se localise sur le bout du pilus chez A. tumefaciens. Les protéines VirB5 font aussi partie du complexe de la membrane interne des T4SS et elles sont essentielles pour la biogenèse et l’élongation du pilus. Nous avons étudié la protéine TraC, un homologue de VirB5 provenant du plasmide IncN pKM101 chez E. coli. Nous avons montré que les formes cellulaires et sécrétées de TraC sont des monomères, et nous avons détecté TraC dans des vésicules membranaires extracellulaires. En utilisant la microscopie à fluorescence à super résolution, nous avons localisé TraC sur le périmètre cellulaire et préférentiellement aux pôles. Nous avons également étudié l’effet de TraC purifiée sur l’infection des bactériophages et sur la conjugaison, vu sa localisation cellulaire et extracellulaire attachée au pilus. Aucun impact de TraC purifiée sur l’infection des bactériophages n'a été constaté, mais nous avons détecté une liaison de TraC aux cellules réceptrices et une complémentation partielle d'une souche n’exprimant pas TraC, suggérant que la protéine TraC contribue à la conjugaison.
Les études sur les T4SSs sont nécessaires pour comprendre le fonctionnement de ces systèmes dans le but de la recherche pour les inhibiteurs, qui vont ainsi limiter la propagation des gènes de résistances aux antibiotiques. De plus, le pilus du T4SS représente le site de reconnaissance et d’adsorption de plusieurs bactériophages avant d’infecter la cellule, d’où l’importance des études structurales sur les pili dans le développement d’une approche alternative pour combattre les bactéries pathogènes. The success of antibiotics in fighting pathogenic bacteria has made their use excessive and uncontrolled in many areas, especially in agriculture and animal husbandry, which has favored the appearance of antibiotic resistance genes. Antibiotic-resistant bacteria are currently a major global public health and an economic problem. Bacteria can exchange or acquire these resistance genes through a secretion system called type IV (T4SS). In Gram-negative bacteria, T4SS is composed of 12 proteins (VirB1 - VirB11, and VirD4) which form a transmembrane translocation channel, an extracellular filamentous structure called pilus, and ATPases.
We used cryo-electron microscopy to study the pilus of T4SS in the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens (T-pilus) and in Escherichia coli from the conjugative plasmid pKM101 (N-pilus). The high-resolution structures obtained for the -T and -N pili (3.2 Å and 3 Å, respectively) show that they are formed from a helical assembly of the pilin/phospholipid complex in a 1:1 stoichiometry. The lumen of the -T and -N pili contains a positively charged amino acid and the mutation of this amino acid in A. tumefaciens (Arg91) leads to a destabilization of the protein and a loss of pilus formation. The phospholipid head is exposed to the pilus lumen and our results showed an effect of phospholipids on the overall charge of the interior of the pilus, which likely influences pilus function during substrate transfer.
The pilus is composed of the VirB2 pilin protein which represents the major component, and of the VirB5 protein, which enters into the composition of the pilus and localizes on the tip of the pilus in A. tumefaciens. VirB5 proteins are also part of the inner membrane complex of T4SS and are essential for the biogenesis and elongation of the pilus. We studied the TraC protein, a VirB5 homologue from the IncN pKM101 plasmid in E. coli. We showed that the cellular and secreted forms of TraC are monomers, and we detected TraC in extracellular membrane vesicles. Using super-resolution fluorescence microscopy, we localized TraC to the cell perimeter and preferentially to the poles. We also investigated the effect of purified TraC on bacteriophage infection and conjugation, given its cellular and extracellular localization attached to the pilus. No impact of purified TraC on bacteriophage infection was found, but we detected binding of TraC to recipient cells and a partial complementation of a traC deletion strain, suggesting that TraC protein contributes to the conjugation.
Studies on T4SSs are necessary to understand the functioning of these systems in order to search for inhibitors, which will thus limit the spread of antibiotic resistance genes. In addition, the pilus of T4SS represents the site of recognition and adsorption of several bacteriophages before infecting the cell, hence the importance of structural studies on pili in the development of an alternative approach to combat pathogenic bacteria.
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