Caractérisation des mécanismes moléculaires et virologiques contribuant à la persistance du VIH-1 chez les individus sous thérapie antirétrovirale

Abstract

Avec près de 35 millions de personnes infectées à travers le monde et 60.000 au Canada, le VIH reste un problème majeur de santé publique. Bien que la thérapie antirétrovirale ait amélioré de façon considérable la qualité et la durée de vie des personnes infectées, elle ne permet pas d’éliminer complètement le virus de l’organisme. Cette persistance virale est liée à l’existence de réservoirs cellulaires et anatomiques dans lesquels le virus persiste par réplication résiduelle et/ou par latence, et au sein desquels le virus est invisible par le système immunitaire et insensible au traitement. La mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éliminer ces réservoirs viraux nécessite une compréhension approfondie de la nature des cellules dans lesquelles le virus persiste et des mécanismes moléculaires et virologiques associés à la persistance virale. Bien que le virus persiste essentiellement dans les lymphocytes T CD4+ mémoires, le phénotype exact des cellules réservoirs reste à déterminer. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de cytométrie en flux (HIV-Flow) permettant la détection des cellules produisant la protéine virale p24 et facilitant l’étude du phénotype des cellules réservoirs. Nos résultats suggèrent que le réservoir viral est constitué d’un ensemble hétérogène de sous-populations cellulaires exprimant divers marqueurs qui ne sont pas spécifiques aux cellules infectées de manière latente. Néanmoins, nous avons identifié certains marqueurs exprimés de façon préférentielle à la surface des cellules p24+, tels que PD-1, TIGIT et l’intégrine a4b1. L’identification d’a4b1 comme marqueur de réservoir viral ouvre la voie à de nouvelles perspectives thérapeutiques. Enfin, nos résultats montrent que les virus compétents pour la traduction protéique persistent dans les 3 sous-populations de lymphocytes T CD4+ mémoires [lymphocytes T CD4+ mémoires centraux (TCM), transitionnels (TTM), et effecteurs (TEM)], mais sont particulièrement enrichis dans les cellules TTM et TEM chez les individus sous ART. Les 3 sous-populations de lymphocytes T CD4+ mémoires dans lesquelles le virus persiste possèdent des propriétés différentes en termes de capacité de survie et de prolifération. La mise au point de protocoles de cytométrie en flux permettant d’étudier divers facteurs impliqués dans l’expression transcriptionnelle du génome proviral (acétylation des histones, NF-kB, PTEF-b) a révélé que ces facteurs sont exprimés à différents niveaux entre les sous-populations, d’où l’importance de tenir compte de l’hétérogénéité des réservoirs viraux. Nous avons également montré que les agents anti-latence ont des capacités différentes à moduler les niveaux de ces facteurs entre les différentes sous-populations. Enfin, grâce au HIV-Flow, nous avons identifié une combinaison d’agents anti-latence capable de réactiver très efficacement le virus dans les i TCM. Des travaux supplémentaires devraient nous permettre de mettre en évidence une combinaison capable de réactiver le virus très efficacement dans toutes les sous-populations. Au-delà des réservoirs cellulaires décrits ci-dessus, le VIH persiste dans une variété de sanctuaires anatomiques. Puisque les ganglions lymphatiques constituent un site de prédilection pour la persistance du VIH, nous avons étudié les mécanismes virologiques de persistance virale dans ce compartiment anatomique. Nous avons montré que la fréquence de cellules T CD4 produisant des ARNs tat/rev spontanément est plus élevée dans les ganglions lymphatiques que dans le sang des mêmes individus. Néanmoins, nous n’avons pas pu observer de production virale active par HIV-Flow dans les ganglions lymphatiques de ces individus, probablement en raison du faible nombre de cellules CD4+ obtenus. En conclusion, les observations réalisées dans le cadre de cette thèse nous aident à mieux comprendre le phénomène de persistance virale, qui constitue le principal obstacle à l’élimination du VIH. Ces résultats devraient aider au développement de stratégies thérapeutiques permettant la rémission des personnes infectées par le VIH.

With nearly 35 million people infected worldwide and 60,000 in Canada, HIV remains a major public health problem. Although antiretroviral therapy (ART) has significantly improved the quality of life and lifespan of HIV-infected people, it does not completely eliminate the virus from the human body. HIV persistence is attributed to the existence of cellular and anatomical reservoirs in which the virus persists through residual replication and/or latency, and in which the virus is invisible to the host immune system and to ART. The development of new therapeutic strategies aimed at eliminating these viral reservoirs requires a thorough understanding of the nature of the cells in which the virus persists and of the molecular and virologic mechanisms contributing to viral persistence. Although the virus primarily persists in memory CD4+ T cells, the exact phenotype of the reservoir cells remains to be determined. The development of HIV-Flow, a flow cytometry-based assay allowing the detection of cells producing the viral protein p24, greatly facilitated the study of the reservoir cells’ phenotype. Our results suggest that the viral reservoir consists of a heterogeneous pool of cell subsets expressing various markers that are not specifically expressed by latently infected cells. Nevertheless, we have identified several markers preferentially expressed on the surface of p24+ cells, including PD-1, TIGIT and the a4b1 integrin. The identification of a4b1 as a marker of viral reservoirs opens the way to new therapeutic perspectives. Finally, our results show that translation-competent viruses persist in the three subsets of memory CD4 + T lymphocytes [central (TCM), transitional (TTM), and effector (TEM) memory lymphocytes], but are particularly enriched in TTM and TEM cells in ART-suppressed individuals. The three subsets of memory CD4+ T cells in which the virus persists have different properties in terms of survival and proliferation. The development of flow cytometry protocols to study various factors involved in the transcriptional expression of the proviral genome (histone acetylation, NF-kB, PTEF-b) revealed that these factors are expressed at different levels between subsets. This observation highlights the importance of taking into account the heterogeneity of viral reservoirs. We have shown that latency reversing agents have different abilities to modulate the levels of these factors between the different subsets. Finally, by using the HIV-Flow assay, we identified a combination of latency reversing agents that is highly effective to reactivate the virus in TCM cells. Further work should permit the identification of a combination that is capable of reactivating the virus very effectively in all subsets. Beyond the cellular reservoirs described above, HIV persists in a variety of anatomical sanctuaries. Since lymph nodes are a major site for HIV persistence, we studied the virologic iii mechanisms of viral persistence in this anatomical compartment. We showed that the frequency of cells producing tat/rev spontaneously is significatively higher in the lymph nodes compared to the blood. Nevertheless, we could not observe active viral production by HIV-Flow in the lymph nodes of these ART-suppressed individuals, probably due to the low number of CD4+ cells analyzed. In conclusion, the observations made in this thesis contribute to a better understanding of the phenomenon of viral persistence, which is the main obstacle to HIV eradication. These results should favor the development of new therapeutic strategies allowing the remission of HIV-infected people.