Étude du rôle du TGF-β dans la différenciation mémoire des lymphocytes T et son implication potentielle pour l'immunothérapie adoptive

Abstract

Au cours des trois dernières décennies, nous avons assisté à l'émergence d'une nouvelle arme dans l'arsenal thérapeutique anticancéreux, l'immunothérapie adoptive (IA). Cette thérapie a connu un succès fulgurant dans le traitement des cancers hématologiques et des mélanomes résistants aux traitements conventionnels, toutefois, son efficacité reste limitée à un nombre réduit de patients. L'efficacité de l'IA repose principalement sur la capacité des LT transférés à migrer vers le site de la tumeur et à l'infiltrer, puis à reconnaitre spécifiquement les antigènes exprimés par la tumeur afin de pouvoir l'éliminer. Ces LT doivent également être capables de contourner le microenvironnement immunosuppressif établi par la tumeur pour échapper à la surveillance immunitaire ainsi que de proliférer et de persister à long terme chez le patient afin d'assurer une protection durable contre une rechute éventuelle. Autant de paramètres que les scientifiques tentent d'améliorer dans le but d'optimiser l'efficacité de cette thérapie afin qu'un plus grand nombre de patients puisse en bénéficier. C'est dans cette optique que s'est inscrit le travail de cette thèse. Plus spécifiquement, nous nous sommes intéressés à deux paramètres en particulier; (i) la capacité des LT à persister in-vivo, reliée au stade de différenciation des LT au moment du transfert adoptif (TA) et (ii) leur capacité à migrer et à infiltrer la tumeur. Plusieurs études indiquent que dans le contexte de l'IA, la différenciation des cellules T est inversement corrélée à leur efficacité anti-tumorale. En effet, le processus de différenciation des cellules T entraîne une perte de leur capacité proliférative, d'auto-renouvèlement ainsi que leur multipotence, ce qui réduit leur persistance et leur capacité à induire une protection à long terme in-vivo. Ainsi, le transfert adoptif de LT peu différenciés, tels que les Tscm (Stem cell like memory T cells) ou les Tcm (Central memory T cells), améliore l'efficacité thérapeutique de l'IA. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons tenté de générer des LT mémoire humains ex-vivo afin d'améliorer l'efficacité de l'IA, en utilisant la cytokine TGF-β (Transforming growth factor beta). En effet, dans la biologie du LT, le TGF-β est surtout connu pour ses effets immunorégulateurs. Cependant, aujourd'hui l'on sait que le TGF-β est bien plus qu'un immunosuppresseur et qu'il exerce ses effets pléiotropiques de façon contexte-dépendant. Notamment, des études récentes ont montré que le TGF-β était nécessaire à la formation et au maintien des LT mémoires. En accord avec ces données, nous avons démontré que l'exposition des LT humains au TGF-β durant leur phase d'activation ex-vivo favorisait une différenciation mémoire des LT, associée à une expression phénotypique et transcriptionnelle similaire à celle observée dans les LT centrale mémoire. Fait intéressant, le TGF-β inhibe l'expression du facteur de transcription BLIMP1, un régulateur clé de la différenciation et de la fonction des LT effecteurs, et augmente celle d'ID3, un facteur important dans la génération et le maintien des LT mémoires. De plus, l'exposition des LT au TGF-β n'a pas altéré leur prolifération, ni leur polyfonctionnalité et n'a pas entrainé la génération de lymphocytes T régulateurs (Treg). D'autre part, le transfert adoptif de LT exposés au TGF-β dans des souris immunodéficientes a induit une plus forte réactivité in-vivo qui s'est traduite par l'apparition plus rapide d'une GVHD (Graft versus host disease) et une meilleure persistance in-vivo. Enfin, le transfert adoptif de LT génétiquement modifiés pour exprimer un CAR (Chimeric antigen receptor) exposés au TGF-β dans des souris immunodéficientes a révélé une meilleure toxicité et a induit une réponse anti-tumorale plus efficace. Notre étude a permis de révéler un nouveau rôle du TGF-β dans la différenciation mémoire des LT humains et a démontré que la signalisation du TGF-β pouvait efficacement être ciblée pour générer des Tcm ex-vivo dans le contexte de l'IA. Le TGF-β a également été associé à la formation et au maintien d'une population de LT récemment identifiée et qui a pour spécificité de résider de façon permanente dans les tissus non-lymphoïdes. Ces LT résidants dans les tissus (Trm) jouent un rôle crucial dans la protection des tissus épithéliaux contre les maladies infectieuses et inflammatoires, mais aussi dans le contrôle de la réponse anti-tumorale. Leur présence dans les tumeurs est associée à un bon pronostic vital et à une meilleure réponse aux immunothérapies. De ce fait, le transfert adoptif de LT ayant des propriétés de Trm, pouvant infiltrer et être retenus plus efficacement dans les tumeurs, pourrait améliorer l'efficacité de l'IA. Dans le deuxième volet de cette thèse, nous avons tenté de déterminer si une brève exposition ex-vivo des LT au TGF-β permettait l'acquisition de caractéristiques favorisant la migration et la rétention des LT transférés au site de la tumeur, dans un modèle murin antigène spécifique (OT-I-OVA). Les résultats obtenus ont montré que le traitement de LT-OT-I avec du TGF-β exogène durant la phase d'activation ex-vivo de ces cellules, favorisait l'expression d'un phénotype de migration et de rétention tissulaire se traduisant, notamment par une plus forte expression de l'intégrine CD103 et du récepteur de chémokines CXCR3. D’un point de vue fonctionnel, les LT-OT-I traités au TGF-β avaient une meilleure capacité à migrer in-vitro en réponse aux ligands recombinants du CXCR3 et aux surnageants de tumeurs épithéliales LLC-OVA (Lewis lung carcinoma exprimant le peptide OVA) et ce, de façon dépendante des récepteurs associées aux protéines Giα, en général, et plus spécifiquement au CXCR3. In vivo, les LT-OT-I traités au TGF-β avaient également une meilleure capacité à migrer et à infiltrer les tumeurs LLC-OVA. Cependant, le transfert adoptif de ces cellules à des souris porteuses d'une tumeur LLC-OVA n'a montré qu'un modeste ralentissement de la progression tumorale à des temps précoces, et qui s'est estompé peu à peu dans le temps. Ces résultats étaient corrélés à une plus importante infiltration tumorale et au maintien de l'expression du CD103 in-vivo. Afin d'améliorer l'efficacité thérapeutique de notre stratégie, il serait intéressant d'envisager une thérapie de combinaison associant le transfert adoptif de LT-OT-I traités au TGF-β avec des inhibiteurs de points de contrôles, par exemple. L'effet synergique de ces deux thérapies permettrait d'améliorer à la fois le recrutement, la rétention ainsi que la cytotoxicité des LT transférés. Nos résultats ont permis de révéler que l’utilisation du TGF-β durant la phase d’activation des LT ex-vivo permet d’induire un phénotype mémoire ainsi qu’un potentiel migratoire et de rétention intra-tumorale pouvant améliorer l’efficacité de l’IA. Le TGF-β pourrait donc être utilise en clinique afin de générer des LT de meilleure qualité pour l’IA.

Over the last three decades, adoptive immunotherapy (IA) has emerged as a curative therapy for advanced hematologic malignancies and melanoma. However, its effectiveness remains limited to only a small number of patients. The efficacy of AI mainly relies on the ability of the transferred T cells to efficiently traffic and infiltrate the tumor, and to specifically recognize tumor antigens. The transferred T cells should also be able to overcome the immunosuppressive microenvironment established by the tumor to evade immune surveillance and to proliferate and persist long-term in the patient to provide protection against eventual relapse. Many efforts have been done to improve these T-cell properties in order to optimize the effectiveness of this therapy so it can benefit to a larger number of patient. In this line, Our work focuses on the improvement of two parameters in particular; (i) the ability of T lymphocytes (LTs) to engraft an persist long-term in-vivo, which is related to their differentiation state at the time of adoptive transfer (AT) and (ii) their ability to traffic and infiltrate the tumor. In the context of AI, several evidences indicate that T cell differentiation is inversely correlated with their anti-tumor efficacy. Indeed, the process of T cell differentiation results in a loss of their proliferative capacity, self-renewal ability and their multipotency, which reduces their persistence and their ability to induce long-term protection against a possible relapse. Thus, adoptive transfer of poorly differentiated LT, such as Stem cell memory T cells (Tscm) or Central Memory T cells (Tcm) improves the therapeutic efficacy of AI. In the first part of this thesis we have attempted to generate human memory LT ex-vivo to improve the efficiency of AI, using the TGF-β cytokine (Transforming growth factor beta). In T cell biology, TGF-β is mostly known for its immunosuppressive properties. However, we now know that TGF-β is much more than an immunosuppressive cytokine and that it exerts its pleiotropic effects in a context-dependent manner. In particular, recent studies have shown that TGF-β is necessary for the formation and maintenance of memory T cells. In concurrence with this, we demonstrated that exposure of human LTs to TGF-β during their ex-vivo activation phase promoted memory T cell differentiation, associated with phenotypic and transcriptional expression similar to that observed in central memory T cells. Interestingly, TGF-β inhibits the expression of the transcription factor BLIMP1, a master regulator of effector T cell differentiation and function, and inversely increases ID3 expression, a key factor in the generation and maintenance of memory T cells. Moreover, the exposure of LTs to TGF-β did not alter their proliferation or polyfunctionality and did not lead to the generation of regulatory T cells (Treg). On the other hand, adoptive transfer of LT exposed to TGF-β in immunodeficient mice induces a greater in-vivo reactivity which resulted in the faster onset of GVHD (Graft versus host disease) and improved persistence in-vivo. Finally, adoptive transfer of genetically engineered LT to express a chimeric antigen receptor (CAR) exposed to TGF-β in immunodeficient mice revealed improved toxicity and induced a more effective anti-tumor response. Our study revealed a new role for TGF-β in human T cell memory differentiation and demonstrated that TGF-β signaling could be targeted to generate Tcm ex-vivo in the context of AI. TGF-β has also been associated with the formation and maintenance of a newly identified LT population that is permanently resident in non-lymphoid tissues. These tissue-resident T cells (Trm) play a crucial role in protecting epithelial tissues against infectious and inflammatory diseases, as well as in controlling the anti-tumor response. Their presence into the tumors is associated with a good prognosis and a better response to immunotherapies. As a result, adoptive transfer of LT with Trm properties, which can infiltrate and be retained more effectively into the tumors, could improve the efficacy of AI. In the second part of this thesis we sought to determine whether a brief TGF-β exposure during ex-vivo T cell activation for AI may confer a tumor infiltration/retention phenotype to effector T cell within tumors in-vivo and hence improve AI efficacy. Using OT-I TcR transgenic model, we found that exogenous TGF-β favors the expression of the integrin CD103 and the chemokine receptor CXCR3 in ex-vivo stimulated OT-I-T cells in the presence of the cognate antigen. We also found that TGF-β-treated T cells exhibited strong migration to recombinant CXCL9, CXCL10 and CXCL11, the three CXCR3 ligands and to LLC-OVA (Lewis lung carcinoma expressing OVA peptide) supernatants. This migration was dependant on Giα proteins associated receptors in general, and more specifically on CXCR3. Furthermore, using in vivo competitive homing assays, we found that TGF-β improves T-cell trafficking in LLC-OVA tumors. Finally, adoptive transfer of TGF-β-treated T cells into LLC-OVA-bearing mice slightly but significantly delayed tumor growth at early time points, which correlated with higher intratumoral T cell infiltration and maintenance of CD103 expression in vivo. In order to improve the therapeutic efficacy of our strategy, it would be interesting to envisage a combination therapy associating the adoptive transfer of LT-OT-I treated with TGF-β with check-point inhibitors. The synergistic effect of these two therapies may enhance both T cell localization within tumor and citotoxicity thereby enhancing the anti-tumor response and improving the therapeutic effectiveness of AI. Our results have revealed that the use of TGF-β during the ex-vivo activation phase of LT promotes the induction a memory phenotype as well as a migratory and intra-tumor retention potential that can improve the efficacy of AI. We have provide the rational for clinical use of TGF-β for the generation of improved T cells for AI.