Analyse des protéines du tégument par virométrie en flux et protéomique des capsides nucléaires du Virus Herpès Simplex de type 1 (VHS-1)

Abstract

Le virus herpès simplex de type 1 (VHS-1) est un agent infectieux hautement contagieux qui constitue un véritable problème de santé mondiale causant de nombreuses pathologies allant de l'herpès labial jusqu’aux plus graves comme l'encéphalite et les complications chez les nouveau-nés. Le virus comporte 4 composants structurels distincts : un génome viral d’ADN double brin linéaire englobé dans une capside icosaèdrale de 125 nm, une couche de protéine appelée tégument, et une enveloppe lipidique dérivée de l'hôte dans laquelle les glycoprotéines virales sont ancrées. Le tégument est un réseau très dense et très complexe comprenant des milliers de copies de protéines de différentes tailles qui relient structurellement l'enveloppe virale à la capside. Ces protéines multifonctionnelles remplissent plusieurs fonctions importantes tout au long du cycle viral. Elles sont impliquées dans le transport des capsides entrantes jusqu’aux pores nucléaires, la maturation et la sortie des particules virales nouvellement formées ainsi que l'acquisition de l'enveloppe finale. Les protéines du tégument ont été largement étudiées dans le but de déterminer leurs rôles dans l'infection et la virulence. Cependant, étant limitées par les techniques conventionnelles, toutes ces études considèrent que l'ensemble de la population virale est responsable du phénotype de l'infection sans tenir compte de l'hétérogénéité possible des protéines tégumentaires entre les particules virales et son impact sur l'infectiosité. Après la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane plasmique conduisant à l'entrée du virus, le génome viral est livré au noyau, où il se réplique afin d’amorcer l'assemblage des nouvelles capsides. À ce stade, quatre espèces distinctes de capsides non enveloppées sont présentes. Les procapsides thermodynamiquement instables, les capsides A et B qui ne parviennent pas à incorporer correctement le génome viral, et les capsides C qui incorporent le génome viral et formeront finalement des virions enveloppés matures. Ces capsides peuvent être distinguées les unes des autres sur la base de leurs composition (ADN et protéines) ainsi que de leur apparence en microscopie électronique. Les capsides A et B sont considérées comme abortives et seuls les C-capsides matures peuvent traverser les deux membranes nucléaires par un mécanisme d'enveloppement / dé-enveloppement et sont finalement réenveloppées dans le TGN. L'acquisition de la couche de tégument est supposée se faire de façon séquentielle du noyau au TGN en passant par le cytoplasme. Cette acquisition est favorisée par un réseau très complexe d’interactions protéiques impliquant la capside et les protéines du tégument. Cependant, la séquence exacte d’addition de ces protéines est encore mal définie. Dans le premier article présenté dans cette thèse et qui a été publié dans Journal of Virology, nous avons analysé la teneur en protéines tégumentaires des particules individuelles du virus de l'herpès simplex 1 en utilisant une approche innovatrice de cytométrie en flux que nous avons développée en laboratoire. Nos données confirment que si certaines protéines virales sont incorporées en quantités contrôlées, d'autres varient considérablement. Ces résultats nous ont également permis de mettre en évidence l’existence d’une corrélation entre l'abondance de protéines tégumentaires spécifiques et l’infectiosité du virus. Dans le deuxième article, l’emploi de la virométrie en flux nous a également permis non seulement d’analyser les capsides nucléaires, mais aussi d’enrichir la pureté des capsides C. Et pour la première fois, on a été capable d’analyser trois types de capsides nucléaires (A, B et C) par spectrométrie de masse et de déterminer leur composition protéique globale. Ceci appuie fortement la doctrine selon laquelle l’acquisition du tégument démarre hâtivement au niveau du noyau et soutient l’implication probable de ces protéines dans l’enveloppement primaire des capsides. Nous avons également découvert la présence de protéines de l’hôte associées aux capsides.

Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a highly contagious infectious agent that constitutes a real global health problem and can cause many pathologies ranging from cold sores to encephalitis and systemic disease in newborns. The virus is composed of 4 distinct structural components: a linear double-stranded DNA viral genome encompassed within a 125 nm icosahedral capsid, a layer of protein called the tegument, and a host-derived lipid envelope in which the viral glycoproteins are anchored. The tegument is a very dense and very complex network comprising thousands of proteins of different sizes that structurally bridge the viral envelope to the capsid. These multifunctional proteins perform several important functions throughout the viral cycle. They are involved in transport and targeting of incoming capsids to nuclear pores, maturation and egress of newly made viral particles, and the acquisition of the final envelope. Tegument proteins have been extensively studied to determine their roles in infection and virulence. However, being limited by conventional techniques, all these studies consider the entire viral population to be responsible for the infectious phenotype without considering the possible heterogeneity of specific tegument proteins among viral particles and its effect on infectivity. Following fusion of the viral envelope with the plasma membrane leading to entry of the virus, the viral genome is delivered to the nucleus, where it replicates and leads to the assembly of new capsids. Here, four distinct nonenveloped capsid species are present. The thermodynamically unstable procapsids, the A‐capsids that fail to properly incorporate the viral genome, the B‐capsids that also lack viral DNA and the C‐capsids that incorporate the viral genome and ultimately form mature enveloped virions. Those capsids can be distinguished from each other based on their composition (DNA and proteins) contents and their appearance in electron microscopy. A- and B-capsids are considered to be abortive and only mature C-capsids can travel across the two nuclear membranes by an envelopment/de‐envelopment mechanism and are ultimately re‐enveloped in the TGN. The acquisition of the tegument layer is believed to be sequential from the nucleus to the TGN via the cytoplasm. This acquisition is favored by a very complex network of protein interactions involving the capsid and the proteins of the tegument. However, the exact sequence of addition of these proteins is still poorly defined. The first paper presented in this thesis has been published in Journal of Virology. Here, we analyzed the protein content of individual herpes simplex virus 1 particles using an innovative flow cytometry approach we developed in the laboratory. Our data confirm that while some viral proteins are incorporated in controlled amounts, others vary substantially. We also highlighted the correlation between the abundance of specific tegument proteins and the infectivity of the virions. In the second paper, the use of flow virometry enabled us not only to analyze the nuclear capsids, but also to increase the purity of C-capsids. And for the first time, we were able to analyze three types of nuclear capsids (A, B and C) by mass spectrometry and determine their overall protein composition. These observations strongly support the hypothesis that acquisition of the tegument proteins starts early at the nucleus and support the likely involvement of these proteins in the primary envelopment of the capsids. We also noted the presence of host proteins associated with capsids.