Détection à grande échelle des réarrangements génomiques et élucidation de leurs mécanismes

Abstract

L’instabilité génomique se définit par l’apparition de modifications à la séquence d’un génome, qui peuvent varier de changements ponctuels d’une base à des réarrangements impliquant des grandes sections de chromosomes. Elle peut se produire suite à des dommages à l’ADN par des mécanismes de réparation sujets à l’erreur, mais également au cours des processus normaux du métabolisme de l’ADN. Certains réarrangements spécifiques sont associés à des maladies génétiques, tandis que des maladies comme le cancer affichent une instabilité génomique généralisée. Dans le but d’étudier les mécanismes menant à l’instabilité génomique, nous avons mis au point une nouvelle approche de détection des réarrangements à partir de séquençage de nouvelle génération. Celle-ci se distingue des méthodes précédentes par sa sensibilité et sa résolution à la base près, qui permettent d’obtenir un portrait plus fidèle des modifications présentes dans le génome d’un organisme. Cette approche nous a permis de caractériser l’instabilité génomique présente dans le chloroplaste d’Arabidopsis thaliana et dans la mitochondrie humaine, découvrant ainsi la prépondérance des inversions à courte distance dans ces génomes. Le mécanisme menant à ce type de réarrangement, nommé demi-tour de réplication, est associé à l’interruption de la réplication par les fourches bloquées, et demeure encore peu compris. Nous avons déterminé à l’aide de lignées mutantes d’A. thaliana que les protéines de liaison à l’ADN simple-brin Whirly et les recombinases de la famille RecA sont toutes deux importantes pour empêcher ces réarrangements. Nous avons ensuite informatisé notre approche de façon à permettre l’analyse de plus grands génomes. Nous avons ainsi découvert la présence de demi-tours de réplication dans les génomes nucléaires de l’humain et de Saccharomyces cerevisiae. L’utilisation de mutants et de stress réplicatifs chez la levure nous ont permis de corréler l’apparition des demi-tours à la stabilisation des fourches de réplication bloquées. Nos résultats ont permis de mettre en valeur l’importance des demi-tours de réplication dans l’instabilité génomique de plusieurs organismes. Bien qu’il s’agisse selon toute vraisemblance d’un mécanisme de redémarrage de la réplication sujet à l’erreur, le demi-tour de réplication n’implique aucun intermédiaire de bris double-brin. Nous proposons donc que le demi-tour de réplication favorise également la résistance aux dommages à l’ADN lorsque la machinerie de recombinaison homologue n’est pas disponible.

Genome instability is defined as a high mutation rate in an organism, ranging from single nucleotide variations to rearrangements involving large chromosome segments. These mutations can occur following the repair of DNA damage by error-prone mechanisms, or even as a result of normal DNA metabolism processes. Some rearrangements at specific loci are linked to genetic diseases, whereas diseases like cancer exhibit generalized genomic instability. To study mechanisms leading to genome instability, we developed a new approach to detect DNA rearrangements from next-generation sequencing data. This approach differs from previous methods by its high sensitivity and base-pair resolution, which provide a more accurate portrait of the variations present in the genome of an organism. This has allowed us to characterize the genome instability present in the chloroplast of Arabidopsis thaliana and in the human mitochondrion. We thus discovered a high level of short-range inversions in these genomes, which can occur as a result of replication U-turns. U-turns are linked to replication fork stalling, but the steps and factors involved in this mechanism remain poorly understood. Using A. thaliana mutants, we have determined that the single-stranded DNA-binding Whirly proteins and the RecA family of recombinases both act to suppress replication U-turns. We then created a computer script to allow our approach to be used on larger genomes, and discovered the presence of U-turns in the nuclear genomes of humans and Saccharomyces cerevisiae. We compared DNA rearrangements in various yeast mutants under different conditions of replication stress, and established a correlation between stabilized stalled replication forks and replication U-turns. Our results highlight the importance of replication U-turns as a mechanism of genome instability in the genomes of several organisms. While U-turns appear mainly as an error-prone mechanism to restart stalled replication forks, it is interesting to note that it does not involve any double-strand break intermediates. We therefore propose that U-turns may also favor resistance to DNA damage when the homologous recombination machinery is not available.