L’efficacité in vitro d'un inhibiteur de VCP de première génération (CB-5083) contre le lymphome canin

Abstract

La « protéine contenant de la valosine» (VCP) est essentielle au maintien de l'homéostasie des protéines intracellulaires par son rôle dans la dégradation des protéines, un processus dont dépendent les cellules cancéreuses. Le but de cette étude était de déterminer l'efficacité et d'élucider le mécanisme d'action moléculaire de CB-5083, un inhibiteur de première classe de VCP conçu pour une utilisation in vivo, dans un modèle de lymphome canin. En utilisant des lignées cellulaires de lymphome (CLBL-1, CL-1 et 17-71) et des cellules mononucléées de sang périphérique fraîchement isolées (PBMC) comme contrôle, nous avons d'abord déterminé les effets du CB-5083 sur la viabilité cellulaire et l'apoptose à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan et de la détection de l’activité des caspases. Nous avons ensuite évalué son effet sur le stress du réticulum endoplasmique, la voie de l'agrésome-autophagie, et la réponse de la protéine dépliée (UPR) par immunobuvardage et des analyses RT-PCR. Les résultats ont démontré une mort cellulaire préférentielle (lignées de lymphome vs PBMC) à des concentrations de l’ordre du nanomolaire (IC50: 120-360 nM). La mort cellulaire a été attribuée à une augmentation de l'apoptose, confirmée par une augmentation de l'activité de la caspase 3/7 dès 6 heures post traitement (1 μM, p <0,0001). Bien que le traitement au CB-5083 n’ait pas eu d’effets délétères sur la voie de l’agrésome-autophagie, le stress du RE et le UPR ont été rapidement induits, comme en témoigne l'augmentation de l'expression de DDIT3 et de ATF-4 suivant l'augmentation de la phosphorylation de eIF2α. Ces résultats valident le CB-5083 en tant qu'agent thérapeutique potentiel pour le traitement du lymphome canin, et identifient DDIT3 comme un biomarqueur de l'inhibition de la cible d’intérêt qui peut être transposé aux études in vivo.

Valosin-containing protein (VCP) is central to the maintenance of cellular protein homeostasis through its role in protein degradation, a process crucial for cancer cell survival. The goal of this study was to determine the efficacy and elucidate the molecular mechanism of action of CB-5083, a first-in-class small molecule inhibitor of VCP designed for in vivo use, in a canine lymphoma model system. Using lymphoma cell lines (CLBL-1, CL-1 and 17-71) and freshly isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as controls, we first determined the effects of CB-5083 on cell viability and apoptosis by trypan blue exclusion and Caspase Glo assays. We then evaluated its effect on ER stress, the aggresome-autophagy pathway, and the unfolded protein response (UPR) by immunoblot and RT-PCR analyses. Results showed a preferential cell kill (lymphoma lines vs PBMCs) at concentrations in the nanomolar range (IC50:120-360 nM). Cell death was attributed to increased apoptosis, as confirmed by increased caspase 3/7 activity as early as 6 hours post treatment (1μM, P<0.0001). Although the aggresome-autophagy path was not affected by CB-5083 treatment, ER stress and the UPR were rapidly induced, as evidenced by increased expression of DDIT3 and ATF4 following increased phosphorylation of eIF2α. These results validate CB-5083 as a potential therapeutic agent for canine lymphoma treatment, and identify DDIT3 as a biomarker for target inhibition that can be translated to in vivo studies.