Mécanismes impliqués dans la modulation de la néovascularisation post-ischémique : rôle de la rénine et des microARNs

Abstract

Les maladies cardiovasculaires ischémiques demeurent à ce jour la principale cause de morbidité et mortalité dans les pays industrialisés. La sévérité des dommages ischémiques est grandement influencée par la capacité adaptative de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux sanguins (néovascularisation). Notre laboratoire a démontré au cours des dernières années que plusieurs facteurs de risques et phénotypes cliniques associés au développement de l’athérosclérose diminuent également la capacité de néovascularisation post-ischémique. Mes travaux de recherche visaient à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la modulation de la néovascularisation post-ischémique en condition pathologique. Nous avons dans un premier temps étudié le rôle spécifique de la rénine, une composante du système rénineangiotensine (RAS) dont la stimulation chronique est impliquée à la fois dans la l’athérosclérose, la dysfonction des cellules endothéliales (ECs) et l’inhibition de la néovascularisation. Par la suite, nous avons investigué le rôle potentiel des micro-ARNs (miRs) lors de la modulation de la néovascularisation post-ischémique en condition athérosclérotique. Les miRs sont des petits ARNs non codants qui régulent négativement l’expression de plus de 60% des gènes. Ils sont de plus en plus reconnus comme ayant un rôle essentiel lors des processus biologiques physiologiques et pathologiques. Dans cette thèse, nous avons utilisé un modèle murin d’ischémie de la patte pour tester l’hypothèse que la rénine et les miRs sont impliqués dans de la modulation de la néovascularisation post-ischémique lors de conditions pathologiques. Les résultats de mon premier article ont permis de démontrer pour la première fois qu’une thérapie avec l’aliskiren, le seul inhibiteur direct de la rénine utilisé cliniquement, permet d’améliorer significativement la néovascularisation post-ischémique in vivo. En effet nous avons observé une amélioration de la récupération de la perfusion tissulaire, de la densité capillaire et artériolaire, et de l’expression de facteurs angiogéniques clés (VEGF, NO) dans les muscles ischémiques de souris traitées à l’aliskiren. En bref, nos résultats suggèrent que l’effet bénéfique de l’aliskiren sur la néovascularisation est au moins en partie causé par une action antioxydante qui améliore l’activité fonctionnelle des ECs et des cellules angiogéniques circulantes (PACs). Mon deuxième projet visait à identifier et caractériser le rôle de différents miRs potentiellement impliqués dans la défaillance de néovascularisation post-ischémique associée aux conditions athérosclérotiques. En utilisant la technologie de séquençage de deuxième génération et le qRT-PCR, nous avons identifié 2 miRs qui sont fortement diminués en condition hypercholestérolémique : le miR-150 (un miR pro-angiogénique) et le miR-146b (un miR anti-inflammatoire). Nous avons démontré que ces 2 miRs sont diminués in vivo dans le muscle ischémique des souris hypercholestérolémiques (HC), et également in vitro dans des ECs humaines exposé aux oxLDL. La diminution de l’expression du miR-150 et du miR-146b par l’hypercholestérolémie et les oxLDL semble inhiber la néovascularisation post-ischémique par deux mécanismes distincts (article 2 et 3). D’une part, la diminution du miR-150 cause une défaillance des fonctions angiogéniques des ECs et des PACs en stimulant l’expression de SRCIN1, un important inhibiteur endogène de la voie pro-angiogénique Src/Akt/eNOS (article 2). D’autre part et de façon similaire aux oxLDL, l’inhibition du miR146b cause une dysfonction endothéliale en augmentant les niveaux de stress oxydant et d’inflammation, un mécanisme qui implique l’induction du gène pro-inflammatoire TRAF6 (article 3). De façon importante, nos résultats démontrent pour la première fois qu’une injection intramusculaire locale de miR-150 ou de miR-146b permet de récupérer la néovascularisation post-ischémique en condition d’hypercholestérolémie. Nous avons aussi démontré que l’expression forcée du miR-150 ou du miR-146b améliore la fonction angiogénique des ECs humaines exposées aux oxLDL. Finalement, le nombre et l’activité fonctionnelle des PACs isolées de la moelle osseuse des souris HC peuvent aussi être restaurés par miR-150 et miR-146b. En conclusion, nos travaux ont permis d’identifier et de caractériser le rôle de miR-150 et de miR-146b dans la défaillance angiogénique lors de conditions athérosclérotiques. Cette thèse démontre aussi pour la première fois que des thérapies basées sur l’inhibition de la rénine ou la modulation de miRs spécifiques permettent d’améliorer la néovascularisation post-ischémique lors de situations pathologiques. Nos résultats pourraient donc aider au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des maladies cardiovasculaires ischémiques sévères.

Ischemic cardiovascular diseases remain the leading cause of morbidity and mortality in industrialized countries. The severity of ischemic damages is greatly influenced by the ability of the organism to form new blood vessels (neovascularization). Our laboratory has demonstrated in recent years that several risk factors and clinical phenotypes associated with the development of atherosclerosis can also impair post-ischemic neovascularization. The purpose of my research was to better understand the mechanisms that are involved in the modulation of post-ischemic neovascularization in pathological conditions. We first investigated the specific role of renin, a key component of the renin-angiotensin system (RAS) whose chronic stimulation is involved in atherosclerosis, endothelial cell (EC) dysfunction and the inhibition of neovascularization. Subsequently, we investigated the potential role of microRNAs (miRs) in the modulation of post-ischemic neovascularization under atherosclerotic conditions. miRs are small non-coding RNAs that negatively regulate the expression of more than 60% of genes. They are increasingly recognized as having a vital role in physiological and pathological biological processes. In this thesis, we used a mouse model of hindlimb ischemia to test the hypothesis that renin and miRs are involved in the modulation post-ischemic neovascularization during pathological conditions.

The results of my first article demonstrate for the first time that treatment with aliskiren, the only direct renin inhibitor used clinically, significantly improves post-ischemic neovascularization in vivo. Indeed, we observed an improvement of tissue perfusion recovery, capillary and arteriolar densities, and higherexpression of key angiogenic factors (VEGF, NO) in ischemic muscles of mice treated with aliskiren. In summary, our results suggest that the beneficial effect of aliskiren on neovascularization is at least in part due to an antioxidant action that enhances the functional activity of ECs and circulating angiogenic cells (PACs). My second project aimed at identifying and characterizing the role of different miRs which could be involved in post-ischemic neovascularization failure associated with atherosclerotic conditions. Using next-generation sequencing technology and qRT-PCR, we identified 2 miRs that are significantly decreased in hypercholesterolemic conditions: miR-150 (a pro-angiogenic miR) and miR-146b (an anti-inflammatory miR). We have shown that these 2 miRs are decreased in vivo in the ischemic muscles of hypercholesterolemic (HC) mice, and also in vitro in human ECs exposed to oxLDL. Decreased expression of miR-150 and miR-146b by hypercholesterolemia and oxLDL appears to inhibit post-ischemic neovascularization by two distinct mechanisms (Article 2 and 3). On one hand, decreased expression of miR-150 impairs the angiogenic functions of ECs and PACs by stimulating the expression of SRCIN1, an important endogenous inhibitor of the pro-angiogenic Src / Akt / eNOS pathway (article 2). On the other hand, decreased expression of miR146b causes endothelial dysfunction by increasing oxidative stress and inflammation, a mechanism that involves the induction of the proinflammatory TRAF6 gene (Article 3). Importantly, our results demonstrate for the first time that a local intramuscular injection of miR-150 or miR-146b can recover post-ischemic neovascularization in hypercholesterolemic conditions. We also show that forced expression of miR-150 or miR-146b can enhance the angiogenic functions of human ECs exposed to oxLDL. Finally, the number and functional activity of bone marrow PACs isolated from HC mice can also be restored by miR-150 and miR-146b. In conclusion, our work has characterized the role of miR-150 and miR-146b for the angiogenic failure associated with atherosclerotic conditions. This thesis also demonstrates for the first time that therapies based on the inhibition of renin or the modulation of specific miRs can improve post-ischemic neovascularization in pathological situations. Our results could help developing new strategies for the treatment of severe ischemic cardiovascular diseases.