Role of the CBL Family of E3-Ubiquitin Ligases in the Humoral Immune Response

Abstract

La production d'anticorps de haute affinité est une des caractéristiques de la réponse immunitaire humorale; elle a lieu dans le centre germinatif. Elle dépend d'un processus de développement séquentiel qui comprend: l'activation des lymphocytes B par l'antigène, le traitement et la présentation de l'antigène aux lymphocytes T auxiliaires, la prolifération et l'hypermutation somatique dans le CG, la sélection des lymphocytes B produisant des anticorps de haute affinité et finalement la différenciation en plasmocytes sécréteurs ou en lymphocytes B mémoire. Des études antérieures ont montré que le développement et l'activation des lymphocytes B dans le CG sont contrôlés par des mécanismes moléculaires, tels que la phosphorylation des protéines, la transcription, les microARNs et la modification épigénétique. Ma thèse vise à poursuivre ces études en explorant le rôle potentiel de l'ubiquitination des protéines dans le développement du CG. Nous avons établi que l'expression de CBL et CBLB (protéines CBL) est considérablement augmentée dans les lymphocytes B du CG comparée à celle des lymphocytes B naïves. De plus dans le CG, les protéines CBL sont exprimées préférentiellement dans les lymphocytes B de la zone claire, plutôt que dans ceux de la zone foncée. Nous avons examiné le rôle des protéines CBL dans le développement et la différenciation des lymphocytes B du CG en utilisant des souris mutantes dans lesquelles l'expression des protéines CBL est, soit réduite conditionnellement avant l'initiation du GC (souris CBLdKO-Mb) ou pendant la réaction de formation du CG (souris CBLdKO-Cg). Nos résultats révèlent que les protéines CBL jouent des rôles critiques dans le contrôle de la formation du CG. En effet les protéines CBL sont requises pour l'absorption, le traitement et la présentation de l'antigène aux cellules T auxiliaires par les lymphocytes B naïves. Ces molécules contrôlent ce processus en favorisant l'internalisation du récepteur de l'antigène des cellules B et la sélection vers les lysosomes pour la dégradation par ubiquitination de l'Ig, un composant du complexe BCR. Cependant après le début de la réaction dans le CG, les protéines CBL contrôlent la sélection d'anticorps de haute affinité, sans toute fois affecter la production totale d'anticorps. En effet en absence des protéines CBL, les lymphocytes B du CG peuvent encore se développer plus ou moins normalement, mais ne peuvent pas produire des clones ayant des BCRs de haute affinité, comparé aux lymphocytes B de type sauvage. Nos analyses ont aussi révélées que les protéines CBL contrôlent cette étape du développement des cellules B du CG en favorisant l'ubiquitination de IRF4, un facteur de transcription exprimé tardivement dans les lymphocytes B du CG ayant vraisemblablement acquis un BCR de haute affinité. L'ensemble nos études montrent que l'ubiquitination induite par les protéines CBL est un mécanisme de régulation important des lymphocytes B. Ces ubiquitines ligases contrôlent les différentes étapes de la réaction CG et d'une façon plus large la génération d'anticorps. Le contrôle des protéines CBL pourrait permettre non seulement de modifier la réponse immunitaire humorale pour le traitement et la prévention des maladies humaines, mais aussi d'améliorer l'immunisation par vaccination.

Production of high affinity antibodies is a hallmark of the humoral immune response and occurs in the germinal center (GC). It depends on a stage-wise developmental process that includes B cell activation, antigen processing and presentation to T follicular helper (Tfh) cells, proliferation and somatic hypermutation in GC, selection and eventual differentiation into antibody-secreting plasma cells (PC) or memory B cells. Previous studies have shown that B cell development and activation in GC are controlled by different molecular mechanisms, such as protein phosphorylation, transcription, microRNA, and epigenetic modification. My thesis tries to extend these studies by exploring the potential role of protein ubiquitination in the GC reaction. We have found that both CBL and CBLB are highly upregulated in GC B cells as compared to naïve B cells and, within the GC B cells, light zone (LZ) GC B cells expressed higher level of CBLs compare to dark zone (DZ) cells. To understand the function of CBLs in the GC reaction, we have examined GC B cell development and differentiation in the mutant mice in which CBLs are either conditionally ablated before GC initiation (in CBLdKO-Mb1 mice) or during GC progression (in CBLdKO-Cg mice). Our findings reveal that CBLs play critical roles in both GC entry and exit checkpoints. At the entry checkpoint of the GC reaction, CBLs are required for naïve B cell antigen uptake, processing, and presentation to Tfh cells. They regulate this process by promoting B cell antigen receptor (BCR) internalization and sorting to lysosome for degradation via ubiquitination Ig, a component of the BCR complex. However, after entering the GC stage, CBLs control selection for high affinity antibodies but not the production of total antibodies, because in the absence of CBLs GC B cells can still develop relatively normally but fail to selectively expand high affinity BCR producing clones as compared to control B cells. Our further analyses reveal that CBLs control this step of GC B cell development by promoting ubiquitination of IRF4, a transcription factor that is upregulated in the later stage GC B cells with high affinity BCR. Together, our studies provide clear evidence that CBL-mediated ubiquitination is an important and novel regulatory mode in B cells that controls different stages of GC reaction and antibody responses. Modulation of the CBL pathway can be a potentially useful approach not only to interfere humoral immunity for the treatment and prevention of human diseases, but also enhance vaccination in the future.