Dveloppement de nouvelles mthodes d'identification des sites de SUMOylation par protéomique

Abstract

La régulation des protéines par les modifications post-traductionnelles (PTMs) est un événement clé dans le maintien des fonctions biologiques de la cellule. Parmi elles, on retrouve les modifications causées par une famille de molécules appelées Ubiquitin Like Modifiers (UBls), incluant l’ubiquitination, la neddylation ou encore la SUMOylation. Au contraire des modifications classiques faisant intervenir des petits groupements chimiques, telles que la phosphorylation ou l’acétylation, les UBls sont eux-mêmes des protéines se greffant sur le groupement amine en position e des lysines des protéines ciblées, générant des protéines ramifiées.

Alors que la principale fonction de l’ubiquitination est la dégradation des protéines par le protéasome, les autres UBls sont encore mal caractérisées. Dans ce contexte, le but de cette thèse était de développer de nouvelles approches protéomiques afin de définir le rôle de la SUMOylation dans des cellules humaines. En effet, l’identification des sites de SUMOylation par spectrométrie de masse (MS) est un défi. Ceci s’explique par la très faible abondance des protéines SUMOylées dans la cellule ainsi que par la longue chaine de 19 à 34 acides aminés laissés sur la protéine ciblée après digestion à la trypsine.

Afin de pallier à ces deux problèmes, un mutant de la protéine SUMO a été généré au sein du laboratoire. La première altération sur ce mutant est l’insertion d’une séquence 6xHis à l’extrémité N-terminale de la protéine afin de faciliter l’enrichissement des protéines SUMOylés. La seconde altération de la protéine SUMO est la mutation d’une glutamine en arginine en position 6 à partir du C-terminal. Cette mutation a pour effet de libérer des peptides trypsiques ramifiés contenant seulement 5 acides aminés provenant de SUMO sur le peptide ciblé.

Le premier but de cette thèse était de développer une méthode permettant de cibler spécifiquement les peptides SUMOylés lors d’une analyse par LC-MS. Cette méthode repose sur le patron de fragmentation propre de la chaine de 5 acides aminés commune à tous les peptides SUMOylés et utilise la technologie Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). Lors d’une telle analyse, l’échantillon est injecté une première fois en fragmentant de larges fenêtres de masses. Ceci permet d’obtenir des spectres MS/MS pour tous les peptides présents dans l’échantillon. Un algorithme est ensuite utilisé afin de détecter les fenêtres de masses contenant des peptides SUMOylés et de recalculer le rapport masse sur charge des peptides candidats. Les injections subséquentes permettent ensuite de fragmenter uniquement les peptides candidats. Cette méthode s’est avérée être complémentaire aux méthodes conventionnelles et a permis l’identification d’un total de 54 peptides SUMOylés à partir d’extraits protéiques enrichis sur billes NiNTA.

La seconde approche envisagée était d’ajouter une étape d’enrichissement supplémentaire au niveau peptidique. Pour cela, un anticorps reconnaissant la chaine de 5 acides aminés laissée après digestion tryptique a été produit. Cette étape d’immuno-purification supplémentaire a permis l’identification d’un total de 954 sites de SUMOylation dans des cellules humaines lors d’une analyse à grande échelle. Afin de valider les nouvelles cibles identifiées, une étude fonctionnelle de la SUMOylation de la protéine CDC73 a été réalisée. Cette étude a montré que la SUMOylation de CDC73 était requise pour sa rétention nucléaire, confirmant ainsi un rôle important pour la SUMOylation de cette protéine.

Cependant, le principal défaut de la précédente approche était la nécessité de cultiver 500 millions de cellules par condition étudiée. Cette approche a donc été optimisée afin de pouvoir réduire le nombre de cellules utilisées dans une analyse. L’optimisation de chacun des paramètres analytiques nous a permis de réduire ce nombre de 50 fois, permettant ainsi d’identifier plus de 1000 sites de SUMOylation à partir de seulement 10 millions de cellules. De plus, nous avons montré que cette approche permet l’identification concomitante des sites de SUMOylation et d’ubiquitination dans un seul échantillon biologique. Ceci a permis d’identifier un nouveau mécanisme de régulation des deubiquitinases par les UBls, ainsi que d’élucider les mécanismes de translocation du protéasome dans la cellule.

Dans l’ensemble, nous avons développé des méthodes permettant de mieux caractériser la SUMOylation des protéines et avons prouvé que ces méthodes sont applicables à l’étude de plusieurs UBls en parallèle. Nous sommes certains que l’approche par immuno-purification permettra à l’avenir d’identifier la SUMOylation à un niveau endogène.

Protein regulation by post-translational modification (PTMs) is a key event in regulating cellular function. These modifications include a group termed Ubiquitin-Like modifiers (UBLs) that contain, but is not limited to, ubiquitylation, neddylation and SUMOylation. While conventional modifications, such as phosphorylation or acetylation, involve a small chemical group, UBLs are proteins attached from their C-terminus to the epsilon amine group of a lysine contained in the targeted protein, thus generating branched proteins. While the main function of ubiquitylation is protein degradation by the proteasome, other UBLs remain mostly unexplored. In this context, the aim of this thesis was to develop new proteomics strategies to characterize SUMOylation in human cells. Indeed, identification of SUMOylation sites by mass spectrometry (MS) is a challenge. This is due to the low abundance of SUMOylated proteins in the cells as well as the long 19 to 34 amino acid SUMO remnant left of the target after trypsin digestion. In this context, our research group has developed a mutant of SUMO containing two mutations. The first mutation consists of a 6xHis tag at the N-terminus of SUMO in order to facilitate SUMOylated substrates enrichment at the protein level. A second mutation was also introduced at the 6th position from the C-terminus and consists in a glutamine to arginine substitution in order to release shorter SUMOylated peptides after trypsin digestion. The first goal of this thesis was to develop a targeted approach to specifically fragment SUMOylated peptides during an LC-MS run. This was enabled by the common fragmentation pattern of all SUMOylated peptides arising from the five amino acid SUMO remnant. Digested peptides were first analyzed using SequentialWindow Acquisition of all THeoretical Mass Spectra (SWATH). In this experiment, large mass windows are fragmented. A custom algorithm is then used that detects mass windows in which candidates are located and determine their intact mass. In subsequent injections these peptides were then specifically targeted. This method was complementary to data dependent acquisition and enabled the identification of 54 SUMOylated peptides. In a second approach, we wanted to enrich for SUMOylated substrates at the peptide level. An antibody was raised against the five amino acid SUMO remnant and used for immunopurification of SUMOylated peptides. In total, we identified 954 SUMOylation sites in human cells. Moreover, functional analysis of the newly identified substrate CDC73 revealed that SUMOylation on K136 is required for its nuclear retention, thus showing a new role for the SUMOylation of this protein. Although this approach gave new insights into the characterization of SUMOylated substrates, high amounts of material were still required to obtain such results. The last goal of this thesis was to optimize the previously developed immunopurification. Systematic optimization of every analytical parameter was done and enabled the reduction of the number of cells required by a factor of 50, without affecting the number of SUMOylation sites identified. Moreover, we used this approach to profile for SUMOylation and ubiquitylation dynamics in human cells upon proteasomal inhibition with MG132. This revealed an unexpected regulation mechanism of deubiquitinating enzymes by UBLs and unraveled translocation mechanisms of the proteasome in the cell. Our SUMO proteomic approach demonstrates capability for the concomitant analysis of SUMOylation and ubiquitylation. In the future, we hope to extend this approach to endogenous SUMOylation.