Identification of transcriptional regulators functions in the human fungal pathogen Candida albicans using functional genomics

Abstract

Candida albicans, une levure pathogène de l’humain, cause des infections envahissantes chez les individus immunodéprimés. C. albicans peut changer sa morphologie entre les formes levures et filamenteuses, un déterminant de virulence considérable qui est influencé par plusieurs facteurs environnementaux comme le pH, le sérum, les nutriments, et le farnesol, une molécule de la détection du quorum. Le génome de C. albicans a été séquencé et à date, plusieurs gènes codant des régulateurs de transcription (RT) restent incaracterisés. Basé sur des criblages à grande-échelle, il a été possible d’attribuer des phénotypes à certains des RT incaractérisés, cependant, leurs cibles traduisant ces phénotypes restent inconnues. Le but de cette thèse était d’étudier les fonctions biologiques de RT sélectionnés et d’établir des réseaux transcriptionnels chez C. albicans. J’ai utilisé des approches génétiques et génomiques afin d’identifier et de caractériser le regulon de ces RT, ce qui a permis de déterminer leur fonctions biologiques. Notre groupe avait identifié Fcr1p, un RT dont la délétion augmente la filamentation et la tolérance à plusieurs antifongiques. Cependant, le mécanisme sous-jacent reste inconnu. Dans le Chapitre 2, j’ai identifié le régulon d’Fcr1p et j’ai trouvé qu’il régule ses cibles de façon complexe étant en même temps un activateur et un répresseur d’expression de gènes. J’ai démontré que Fcr1p agit comme répresseur direct des gènes de l’assimilation et du métabolisme de l’azote. L’expression de plusieurs de ces cibles était dépendante d’Fcr1p en conditions d’épuisement d’azote. J’ai montrés que Fcr1p agit aussi comme répresseur indirect de gènes hyphe-spécifiques ainsi qu’un activateur indirect de transport et de métabolisme du carbone et de gènes levure-spécifiques. De plus, la suréxpression d’Fcr1p abolit la filamentation sur le milieu Spider, confirmant que c’est un répresseur de filamentation. Dans le Chapitre 3, j’ai décris un crible génétique basé sur un principe de co-culture pour identifier des mutants de RT défectueux en production de farnesol. Conséquemment, les RT Ada2p, Cas5p, Fgr15p, Cas1p, et Rlm1p, impliqués dans le maintien de la paroi cellulaire, ont été identifiés. La quantification du farnesol intracellulaire de ces mutants a confirmé que le défaut observé peut être attribué à un défaut de la biosynthèse de farnesol plutôt qu’à un défaut de sécrétion de celui-ci. Pour comprendre le mécanisme responsable de ce défaut, nous avons commencé par caractériser le régulon de Cas5p par des analyses de profilages d’expression et de localisation. J’ai montré que Cas5p se lie à des gènes impliqués dans le catabolisme des hydrocarbures et la production d’énergie. Cas5p induit aussi des gènes impliqués dans le catabolisme des hydrocarbures et des lipides et réprime des gènes impliqués dans le métabolisme primaire, montrant que Cas5p régule plusieurs voies métaboliques, notamment celle du carbone. En plus des fonctions d’Ada2p et Rlm1p dans la liaison et/ou la régulation de gènes du catabolisme des hydrocarbures, nos résultats appuient avec la proposition que le farnesol constitue une traduction du métabolisme du carbone cellulaire. Dans l’ensemble, ces résultats ont aidé à élucider le rôle d’Fcr1p ainsi que 5 autres RT dans la régulation de voies métaboliques fondamentales influençant le dimorphisme, un attribut crucial de la virulence chez C. albicans.

Candida albicans, an important human fungal pathogen, causes life-threatening invasive infections in immuno-compromised individuals. It switches between yeast and filamentous forms. This dimorphism is a considerable virulence attribute and one that is influenced by many environmental factors, such as pH, serum, nutrients and farnesol, a quorum sensing molecule. The genome of C. albicans has been sequenced and to date, many of the genes encoding transcriptional regulators (TRs) remain uncharacterized. Based on large-scale screens, it was possible to assign phenotypes to some of the uncharacterized TRs, however the targets of these TRs that mediate these phenotypes remain to be identified. The aim of this thesis work was to understand the normal biological function of selected TRs and construct transcriptional networks in C. albicans. I used genetic and genomic approaches to identify and characterize the regulon of these TRs, which helped to define their biological functions. Our group has previously identified Fcr1p, a zinc cluster TR whose deletion increases cell tolerance to multiple drugs and enhances filamentation. However, the mechanism by which it mediates these phenotypes is still unknown. In Chapter 2, I identified the regulon of Fcr1p and found that it regulates its targets in a complex manner since it can act both as an activator and as a repressor of gene expression. I have shown that Fcr1p acts as a direct negative regulator of genes involved in nitrogen source assimilation and metabolism. The Fcr1p-dependent expression of a number of its targets also occurs under nitrogen starvation conditions. Results also showed that Fcr1p is an indirect negative regulator of hyphal-specific genes, and an indirect positive regulator of carbon source transport and metabolism, as well as yeast-specific genes. Furthermore, Fcr1p overexpression abrogates filamentation on Spider medium confirming that it is a negative regulator of filamentation. In Chapter 3, I describe a genetic screen based on a co-culture assay with A. nidulans to identify TR mutants defective in farnesol production. Our results identified Ada2p, Cas5p, Fgr15p, Cas1p, and Rlm1p, five TRs involved in cell wall integrity. Intracellular farnesol quantification in these mutants confirmed that the observed defect in farnesol production could be attributed to impairment in farnesol biosynthesis rather than export of this molecule. To get an insight into the molecular mechanism responsible for this defect, we started by identifying the regulon of Cas5p using expression and location profiling. Results showed that Cas5p binds genes involved in carbohydrate catabolism and energy production. Cas5p also upregulates genes involved in carbohydrate and lipid catabolism and downregulates genes involved in primary metabolism, indicating that Cas5p is involved in the regulation of many pathways, with a clear involvement in carbon metabolism. Coupled to the known function of Ada2p and Rlm1p in binding and/or regulating genes involved in carbohydrate catabolism, our results support the proposition that farnesol is a metabolic read-out of the cell carbon metabolic activity. Taken together, these results helped elucidate the role of Fcr1p as well as five other TRs in the regulation of central metabolic pathways that influence morphological switching, a crucial attribute of C.albicans virulence.