Effects of the mycotoxin, deoxynivalenol, and its major metabolite, de-epoxy deoxynivalenol, on bovine reproduction

Abstract

Le Deoxynivalenol (DON) est une mycotoxine majeure retrouvée dans l’alimentation animale et celle-ci est connue pour réduire la fertilité des truies en inhibant la sécrétion de progestérone par les cellules de granulosa. Chez le bétail, DON est métabolisée en de-epoxy DON (DOM-1) dans le rumen, et DOM-1 peut atteindre des concentrations élevées dans le sang et les liquides folliculaires. Une des voies majeures de signalisation activée par DON est le ribotoxic stress response (RSR), lequel induit une auto-phosphorylation de la protéine kinase R (PKR) et réduit l’activation des MAP kinases incluant la MAPK3/1. Il n’a pas encore été démontré que ces mycotoxines affectent la reproduction chez les bovins. Les objectifs de cette thèse sont (1) de déterminer comment et à quelles doses DON affecte la fonction des cellules de granulosa et d’élucider les mécanismes d’action entrant en jeu; et (2) déterminer comment et à quelles doses la mycotoxine majeure DON et son métabolite DOM-1, affectent la fonction des cellules de la thèque chez le bétail. Les résultats sont présentés dans trois articles distincts. Dans le premier article, nous explorons les effets de DON sur les cellules de granulosa bovines; les traitements avec DON résultant en une inhibition significative de la sécrétion d’oestradiol et de progestérone (P4), et en une augmentation de la proportion de cellules apoptotiques après 4 jours de traitement. Les expériences de Western-Blot démontrent une stimulation significative de la phosphorylation de ERK1/2 et de MAPK14 entre 15 et 30 minutes après le début du traitement des cellules par DON. Par la suite, nous avons déterminé les effets de DON sur les gènes cibles de ERK1/2. En effet, les niveaux d’ARNm de EGR1 et FOS sont transitoirement augmentés avec des niveaux maximum à 1h de traitement par DON, tandis que les niveaux d’ARNm de iv COX2 et GADD45B sont augmentés mais plus de 24h après le début du traitement par DON. Dans le second article, les effets de DON et DOM-1 sur les cellules de thèque ont été étudiés. Le traitement des cellules par DOM-1 résulte en une inhibition dosedépendante de la sécrétion de P4 et de testostérone, et en une augmentation de la proportion de cellules apoptotiques, tandis que DON inhibe la sécrétion de P4 sans altérer celle de la testostérone ou bien le pourcentage de cellules mortes. Les deux mycotoxines sont effectives de manière maximale à des concentrations de 1 ng/ml (en revanche, DON affecte les cellules de granulosa à 100 ng/ml). Les résultats de Western-Blot démontrent la phosphorylation rapide de MAPK3/1, PKR et de JUN kinase après un traitement par DON ou DOM-1. En présence d’un inhibiteur spécifique de PKR, DON et DOM-1 sont incapables d’induire la phosphorylation de MAPK3/1, et l’effet inhibiteur de DON sur la phosphorylation de MAPK14 est en partie abrogé. Néanmoins, l’inhibiteur de PKR augmente davantage la phosphorylation de MAPK14 induite par DOM-1. Ensemble, ces résultats suggèrent que DON active le RSR dans les cellules de thèque et les cellules de granulosa bovines, et que les cellules de la thèque sont plus sensibles que les cellules de granulosa aux effets de DON. Ces données démontrent pour la première fois l’habilité de DOM-1 à affecter les fonctions et la survie cellulaires.

Deoxynivalenol (DON) is a major mycotoxin found in animal feed and is known to reduce fertility in pigs by inhibiting progesterone secretion from granulosa cells. In cattle, it is metabolized to de-epoxy DON (DOM-1) in the rumen, and DOM-1 can reach high concentrations in blood and follicular fluid. One of the major pathways activated by DON is the ribotoxic stress response (RSR), which involves autophosphorylation of protein kinase R (PKR) and downstream activation of MAP kinases including MAPK3/1. It is not known if these mycotoxins affect bovine reproduction. The objectives of present thesis were (1) to determine how and at what doses DON affects ovarian granulosa cell function and to elucidate its mechanism of action; and (2) to determine how and at what doses major mycotoxin DON and its metabolite DOM-1 affect theca cell function in cattle. The results are separated into three articles. In the first article the effects of DON on granulosa cells were explored; treatment with DON resulted in a significant inhibition of estradiol and progesterone (P4) secretion, and an increase in the proportion of apoptotic cells after 4 days of treatment. Western blot demonstrated significant upregulation of ERK1/2 and MAPK14 phosphorylation within 15-30 minutes of adding DON. We then determined the effect of DON on ERK1/2 target genes; EGR1 and FOS mRNA levels were transiently stimulated with maximum levels at 1 h of adding DON, whereas COX2 and GADD45B mRNA levels were upregulated but not until 24 h after DON treatment. In the second article, the effects of DON and DOM-1 on theca cells were assessed. Treatment with DOM-1 resulted in a dose-dependent inhibition of P4 and testosterone secretion, and an increase in the proportion of apoptotic cells, while DON inhibited P4 but did not alter testosterone secretion or the percentage of dead cells. Both ii DON and its metabolite were maximally effective at concentrations of 1 ng/ml (in contrast, the effects of DON on occur at 100ng/ml). Western blot demonstrated rapid phosphorylation of MAPK3/1, PKR and of JUN kinase after addition of DOM-1 or DON. Interestingly, phosphorylation of MAPK14 was significantly increased by DOM-1 but decreased by DON. The addition of a PKR inhibitor abrogated the ability of DON and DOM-1 to increase phosphorylation of MAPK3/1, and partly abrogated the inhibitory effect of DON on MAPK14 phosphorylation, however, the PKR inhibitor further increased the phosphorylation of MAPK14 caused by DOM-1. Together, these results suggest that DON activates the RSR in bovine granulosa and theca cells, and that theca cells are more sensitive than granulosa cells to the effects of DON. The data also demonstrate for the first time in any cell type the ability of DOM-1 to affect cell function and health.