Étude de la régulation de l'activité du ligand Delta dans le cadre de la signalisation Notch

Abstract

La voie de signalisation Notch est conservée au cours de l'évolution. Elle joue un rôle clé dans le développement, et elle est impliquée dans de nombreuses décisions de destin cellulaire, dans le maintien des cellules souches, et dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Une dérégulation de la signalisation Notch est impliquée dans diverses maladies et cancers, y compris les tumeurs solides, comme les cancers du sein et du col de l'utérus, et les leucémies, comme la Leucémie Aiguë Lymphoblastique des cellules T (LAL-T). Notch est un récepteur transmembranaire activé par des ligands transmembranaires de la famille DSL (Delta/Serrate/Lag-2). Bien que plusieurs mutations oncogéniques ont été identifiées au niveau du récepteur Notch, de nombreux cancers modulés par Notch demeurent ligand-dépendants. Étonnamment, les mécanismes moléculaires régulant l'activation du ligand sont encore relativement peu caractérisés par rapport à ceux qui régissent le récepteur Notch lui-même. Utilisant un essai de co-culture avec un rapporteur luciférase de Notch, nous avons effectué le premier crible d'ARNi pan-génomique visant spécifiquement à identifier des régulateurs des ligands de Notch dans la cellule émettrice du signal. Nous avons ainsi pu découvrir de nouvelles classes de régulateurs communs pour les ligands Delta-like1 et 4. Ces régulateurs comprennent des inhibiteurs de protéases, des facteurs de transcription, et des gènes divers à fonction inconnue, tels que Tmem128 « Transmembrane protein 128 », ou à fonction préalablement caractérisée tels que la co-chaperonne moléculaire Cdc37 « Cell division cycle 37 homolog ». Par la suite, nous avons développé des cribles secondaires fonctionnels où nous avons démontré l'importance de ces régulateurs pour des événements Notch-dépendants, comme la différenciation des cellules T normales, et la survie des cellules souches pré-leucémiques isolées à partir d'un modèle murin de LAL-T. En outre, nous avons prouvé que les régulateurs les plus forts du crible de survie sont également nécessaires pour l'activité d'auto-renouvellement des cellules souches pré-leucémiques. Finalement, nous avons entamé une caractérisation moléculaire préliminaire de deux régulateurs nouvellement identifiés; Tmem128 et Cdc37 afin d'étudier leur mécanisme d'action sur les ligands. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier de nouveaux régulateurs de la voie Notch qui pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers; tel qu'illustré par le modèle LAL-T. La compréhension des détails moléculaires sous-jacents aux fonctions de ces régulateurs sera essentielle afin de développer des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer leur action et entraver la signalisation Notch dans le cancer.

The Notch signalling pathway is evolutionarily conserved. It plays a key role in development and it is involved in multiple cell fate decisions, in the maintenance of stem cells, and in the regulation of cell proliferation and differentiation. Misregulation of Notch signalling is implicated in various diseases and cancers including solid tumours, such as breast and cervical cancers, and leukemias, such as T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL). Notch is a transmembrane receptor activated by transmembrane ligands of the DSL family (Delta/Serrate/Lag-2). Whereas oncogenic mutations have been identified in the Notch receptor, many Notch-mediated cancers remain ligand-dependent. Strikingly, the molecular mechanisms that regulate ligand activation are still poorly characterized as compared to those regulating the Notch receptor itself. Using a co-culture assay with a luciferase Notch reporter, we performed the first genome-wide RNAi screen aiming specifically at identifying regulators of Notch ligands in the signal-sending cell. We thereby unraveled new classes of common regulators for both Delta-like1 and 4 ligands. These regulators include protease inhibitors, transcription factors and various genes of unknown function such as Tmem128 (Transmembrane protein 128), or of previously characterized function such as the molecular co-chaperone Cdc37 (Cell division cycle 37 homolog). We next developed functional secondary screens where we demonstrated that our hits are important for Notch-mediated events, such as normal T-cell differentiation, and survival of pre-leukemic stem cells (pre-LSCs) isolated from a mouse model of T-ALL. Moreover, we showed that top hits from the pre-LSC survival screen are also required for the self-renewal activity of pre-LSCs. Finally, we performed a preliminary molecular characterization of two newly identified regulators; Tmem128 and Cdc37 in order to investigate their mechanism of action on Delta-like ligands. Altogether, this study led to the identification of novel Notch pathway regulators that could serve as potential therapeutic targets in Notch cancers, as exemplified by the T-ALL model. Elucidating the finer details that underlie the molecular functions of these regulators will be critical to develop pharmacological inhibitors to counteract their action and impede Notch signalling in cancer.