Expansion des mégacaryocytes par HoxB4 pour accélérer la reconstitution plaquettaire

Abstract

La greffe de cellules souches hématopoïétiques est parfois le seul traitement efficace contre les cancers hématologiques ainsi que plusieurs autres désordres reliés au système hématopoïétique. La greffe autologue est souvent le traitement de choix pour les patients atteints de lymphome ou de myélome. Dans ce cas, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) du patient sont récoltées et congelées. Le patient subit ensuite des traitements de chimiothérapie et/ou radiothérapie qui éliminent les cellules malignes, mais détruisent aussi son système hématopoïétique. Ce dernier sera ensuite reconstitué par la greffe de CSH. Ces traitements ont pour conséquence de plonger le patient en état d’aplasie pour une période variant de 2 à 4 semaines. La thrombocytopénie (faible taux de plaquettes) est une complication majeure nécessitant des transfusions plaquettaires répétées et associée à une augmentation de la mortalité hémorragique post-transplantation. Il serait particulièrement intéressant de développer une thérapie accélérant la reconstitution des mégacaryocytes (MK), ce qui aurait pour effet de raccourcir la période de thrombopénie et donc de diminuer les besoins transfusionnels en plaquettes et potentiellement augmenter la survie. HOXB4 est un facteur de transcription qui a déjà démontré sa capacité à expandre les CSH et les progéniteurs multipotents (CFU-GEMM) donnant naissance aux MK. Il est donc un bon candidat pour l’expansion des progéniteurs MK. Comme la protéine HoxB4 a par contre une courte demi-vie (~1.1h), des protéines HoxB4 de deuxième génération avec une plus grande stabilité intracellulaire ont été créées (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) et 1427 (HoxB4Y28A)). Nous avons donc étudié la capacité d’HoxB4 sauvage et de deuxième génération à expandre les CSH, ainsi que les MK donnant naissance aux plaquettes. La surexpression rétrovirale de ces protéines HoxB4Y23A et HoxB4Y28A conduit à une expansion des progéniteurs MK murins in vitro supérieure à HoxB4-wt, 1423 et au contrôle GFP. La reconstitution plaquettaire in vivo dans un modèle murin a ensuite été évaluée par des transplantations primaires et secondaires. Les résultats révèlent que la surexpression rétrovirale des différents HoxB4 n’apporte pas de bénéfice significatif à la reconstitution plaquettaire des souris. Lorsque cultivées dans un milieu favorisant la différenciation mégacaryocytaire, le traitement de cellules CD34+ dérivées du sang de cordon ombilical avec les protéines recombinantes TATHoxB4WT ou de seconde génération n’a pas augmenté la production plaquettaire. Par contre, de manière intéressante, les cellules CD34+ provenant de sang mobilisé de patients atteints de myélome et mises en culture dans un milieu favorisant l’expansion des CSH ont montré des différences significatives dans la différenciation des progéniteurs MK en présence de la protéine recombinante TATHoxB4. La protéine HOXB4 possède donc un avenir prometteur quant à une amélioration de l’état thrombocytopénique chez les patients.

Haematopoietic stem cell (HSC) transplantation is the most efficient treatment against a number of cancers or other disorders of the hematologic system. Prior to HSC transplantation, patients are exposed to high doses of radiotherapy and/or chemotherapy to eliminate malignant cells. However, these treatments result in a state of aplasia, particularly in thrombocytopenia, which is characterised by very low blood platelet counts. Platelets produced by megakaryocytes (MK) are essential components of the blood system and play a critical role in the prevention of bleeding. Thus a low platelet blood level is a major complication and contributes significantly to transplant related mortality. At present, regular infusion of platelets isolated from healthy donors is the treatment of choice for thrombocytopenia. However, this is cumbersome for patients as well as donors and, in many instances results in platelet refractoriness due to the generation of auto-antibodies against disparate HLA molecules expressed on donor platelets. Therefore, the development of strategies to accelerate MK production and thus platelet reconstitution post HSC transplant would represent a major advance. It has already been shown that HoxB4 expands HSC and multipotent progenitors (CFU-GEMM) that give rise to megakaryocytes (MK). Thus HoxB4 is a great candidate for in vitro MK progenitor expansion. However, the short half-life of HoxB4 protein prompted us to generate a second generation of HoxB4 proteins with greater intracellular stability. We therefore studied the capacity of wild type (WT) and HoxB4 with 3 substitutions (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) and 1427 (HoxB4Y28A) resulting in a longer protein half-life to expand HSC as well as MK progenitors. Retroviral-mediated expression of HoxB4Y23A and HoxB4Y28A proteins showed a greater expansion of murine MK progenitors, in comparison with HoxB4WT or HoxB4L7A proteins or GFP control. We also evaluated the ability of HSC expressing second generation HoxB4 to generate platelets in a murine model. Our results show that retroviral-mediated transduction of second generation HoxB4 in murine HSC does not provide a significant advantage over HoxB4WT in platelet reconstitution in mice. Interestingly, treatment of CD34+ cells derived from cord blood showed only marginal effect of HoxB4WT or second generation HoxB4 soluble recombinant proteins when cultured under conditions optimized for megakaryocyte differentiation. Unexpectedly, CD34+ cells derived from mobilized peripheral blood of myeloma patients showed a significant increase in MK progenitor differentiation in the presence of TAT-HoxB4WT when cultured in expansion medium for HSC. Thus, HoxB4 holds promise in autologous HSC transplantation for the treatment of thrombocytopenic patients.