Étude de la fonction de la protéine RPAP4 et de son association avec l’ARN polymérase II

Abstract

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription.

Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules.

La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau.

Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante.

RNA polymerase II, the enzyme responsible for transcription of messenger RNA, decodes the genome of living organisms. This function requires the concerted action of several proteins, including transcription factors, which form a protein-protein interaction network. Many of them are implicated in the regulation of RNAPII transcription. Although regulation of transcription has been largely studied during the last four decades, little is known about mechanisms that regulate RNAPII prior and after the transcription reaction.

In the first part of this thesis, we continue the characterization of the RNAPII interaction network of RNAPII in the soluble fraction of the human cell. This network, developed using tandem affinity purification method coupled with mass spectrometry (AP-MS) and bioinformatic analysis, provides a wealth of information about RNAPII regulation prior and after its interaction with chromatin for transcription. We identified proteins that can be involved in RNAPII assembly, including chaperones and the cochaperone complex R2TP prefoldin-like, and proteins involved in nucleocytoplasmic shuttling. RPAP4 is a GTPase that occupies a central position in this network being at the interface between these regulatory proteins and RNAPII. We therefore started to study the function of RPAP4, which lead us to conclude that RPAP4 is essential for RNAPII nuclear import. We also report that G domains and the GPN motif are essential for RPAP4 function. Treatment of the cells with benomyl suggests that microtubules are required for RPAP4 function and RNAPII nuclear import.

The second part concerns another protein found in the network that is also centrally positioned in the network, called RPAP2. RPAP2 shares many interactions with RPAP4. This protein is also essential for the nuclear import of RNAPII as it interacts directly with it. RPAP4 and RPAP2 being cytoplasmic proteins that shuttle between the cytoplasm and the nucleus, we show evidences that RPAP4 is implicated in RPAP2 nuclear export to make it available for RNAPII nuclear import.

In the third part, we study RPAP4 post-translational modifications, which help us to understand its own regulation and its function with RNAPII. RPAP4 is phosphorylated in mitosis by the MAP kinase ERK5. This phosphorylation promotes the interaction between RPAP4 and RPAP2. It prevents RPAP2 and RNAPII interaction and RNAPII chromatin localization in mitosis where transcription is mostly nonexistent.