Points quantiques : caractérisation et applications en sciences pharmaceutiques

Abstract

L’imagerie médicale a longtemps été limitée à cause des performances médiocres des fluorophores organiques. Récemment la recherche sur les nanocristaux semi-conducteurs a grandement contribué à l’élargissement de la gamme d’applications de la luminescence dans les domaines de l’imagerie et du diagnostic. Les points quantiques (QDs) sont des nanocristaux de taille similaire aux protéines (2-10 nm) dont la longueur d’onde d’émission dépend de leur taille et de leur composition. Le fait que leur surface peut être fonctionnalisée facilement avec des biomolécules rend leur application particulièrement attrayante dans le milieu biologique. Des QDs de structure « coeur-coquille » ont été synthétisés selon nos besoins en longueur d’onde d’émission. Dans un premier article nous avons modifié la surface des QDs avec des petites molécules bi-fonctionnelles portant des groupes amines, carboxyles ou zwitterions. L’effet de la charge a été analysé sur le mode d’entrée des QDs dans deux types cellulaires. À l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques spécifiques à certains modes d’internalisation, nous avons déterminé le mode d’internalisation prédominant. L’endocytose par les radeaux lipidiques représente le mode d’entrée le plus employé pour ces QDs de tailles similaires. D’autres modes participent également, mais à des degrés moindres. Des disparités dans les modes d’entrée ont été observées selon le ligand de surface. Nous avons ensuite analysé l’effet de l’agglomération de différents QDs sur leur internalisation dans des cellules microgliales. La caractérisation des agglomérats dans le milieu de culture cellulaire a été faite par la technique de fractionnement par couplage flux-force (AF4) associé à un détecteur de diffusion de la lumière. En fonction du ligand de surface et de la présence ou non de protéines du sérum, chacun des types de QDs se sont agglomérés de façon différente. À l'aide d’inhibiteur des modes d’internalisation, nous avons corrélé les données de tailles d’agglomérats avec leur mode d’entrée cellulaire. Les cellules microgliales sont les cellules immunitaires du système nerveux central (CNS). Elles répondent aux blessures ou à la présence d’inflammagènes en relâchant des cytokines pro-inflammatoires. Une inflammation non contrôlée du CNS peut conduire à la neurodégénérescence neuronale et est souvent observée dans les cas de maladies chroniques. Nous nous sommes intéressés au développement d’un nanosenseur pour mesurer des biomarqueurs du début de l’inflammation. Les méthodes classiques pour étudier l’inflammation consistent à mesurer le niveau de protéines ou molécules relâchées par les cellules stressées (par exemple monoxyde d’azote, IL-1β). Bien que précises, ces méthodes ne mesurent qu’indirectement l’activité de la caspase-1, responsable de la libération du l’IL-1β. De plus ces méthode ne peuvent pas être utilisées avec des cellules vivantes. Nous avons construit un nanosenseur basé sur le FRET entre un QD et un fluorophore organique reliés entre eux par un peptide qui est spécifiquement clivé par la caspase-1. Pour induire l’inflammation, nous avons utilisé des molécules de lipopolysaccharides (LPS). La molécule de LPS est amphiphile. Dans l’eau le LPS forme des nanoparticules, avec des régions hydrophobes à l’intérieure. Nous avons incorporé des QDs dans ces régions ce qui nous a permis de suivre le cheminement du LPS dans les cellules microgliales. Les LPS-QDs sont internalisés spécifiquement par les récepteurs TLR-4 à la surface des microglies. Le nanosenseur s’est montré fonctionnel dans la détermination de l’activité de la caspase-1 dans cellules microgliales activées par le LPS. Éventuellement, le senseur permettrait d’observer en temps réel l’effet de thérapies ciblant l’inflammation, sur l’activité de la caspase-1.

Medical imaging based on fluorescence has suffered from the poor photostability and mediocre performance of organic fluorophores. The discovery and subsequent improvements in nanocrystal synthesis and functionalization has greatly benefited the applications in medical imaging and the development of nanocrystal-based sensors for diagnostics. QDs are semi-conductor nanocrystals which have similar sizes as proteins (2-10 nm). They are highly luminescent, and can be made to emit at any desired wavelength by varying their size and composition. The surface of QDs can be easily functionalized with biomolecules. Hence, it is interesting to study how QDs interact in the biological world. Highly luminescent core-shell QDs emitting at different wavelengths were prepared according to our needs. In a first study, the surface of the QDs was modified with various small bi-functional thiolated ligands (carboxylated, aminated and zwitterionic). The modified-QDs of nearly identical sizes were administered in vitro to study the impact of surface charge and cell type on the mode and extent of cell uptake and elimination. Using specific inhibitors of cell uptake we determined which modes contributed to the internalization of the QDs. Endocytosis mediated by lipid rafts represented the predominant pathway for the internalization of QDs. However, other modes contributed to a lesser degree, depending on the surface ligand. We then analyzed the effect of QD agglomeration in cell culture media on its cellular uptake by microglia. Thorough characterization of QD agglomerate size distribution was conducted by asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4) with a dynamic light scattering detector. Depending on the type of surface ligand and if serum proteins were present, the agglomeration pattern of the QDs was significantly different. With inhibitors of specific modes of cell uptake, we showed that the size distribution data, obtained by AF4, correlated with the modes of cell uptake. Microglia cells are immune cells of the central nervous system (CNS). They respond to injury or the presence of inflammagens by producing pro-inflammatory cytokine. Inflammation in the CNS may lead to loss of neurons, and can found in many chronic diseases. We were interested in building nanosensors to measure the onset of inflammation. Current methods to study inflammation consist in measuring levels of certain proteins or chemicals released by stressed cell (e.g. Western blot or ELISA assay for IL-1β). Although precise, these methods measure indirectly the activity of the enzyme responsible for releasing IL-1β, i.e. caspase-1. Moreover, these methods cannot be applied to live cells. We designed a sensor based on FRET between a QD and a dye linked by a peptide specifically cleaved by the caspase-1. To induce inflammation, we applied lipopolysaccharides (LPS), which are endotoxins present in Gram negative bacteria responsible for sceptic shock. The LPS form nanoparticles due to their amphiphilicity. The interior hydrophobic regions were used to load hydrophobic QDs, making the LPS luminescent. The microglia internalized LPS-QD predominantly through TLR-4 membrane receptors. We describe how the LPS induce inflammation and demonstrated the functionality of the QD-based sensor. Eventually, the sensor could be used to monitor in real time the action of therapeutics against inflammation.