Isolation, culture et caractérisation phénotypique de cellules musculaires lisses endobronchiques équines

Abstract

Le muscle lisse endobronchique est l’un des acteurs principaux de l’asthme. La description de ces caractéristiques phénotypiques reste cependant très elliptique, notamment à cause de la difficulté inhérente à l’échantillonnage. Le cheval offre un large champ d’investigation en raison de sa taille et un modèle d’asthme pertinent en regard de la similitude entre asthme et souffle. La technique de culture et de caractérisation du muscle lisse a été mise au point à partir de muscle lisse trachéal. Ce modèle a ensuite été transposé et réalisé à partir de biopsies endobronchiques chez le cheval. Les cellules du muscle lisse ont été isolées, mises en culture puis caractérisées par immunofluorescence, cytométrie de flux et immunobuvardage. Le maintien du phénotype contractile en culture restant un défi dans l’établissement d’un modèle d’asthme réaliste.

Suite à l’isolement des cellules musculaires lisses à partir de muscle lisse trachéal équin et leur mise en culture en présence de 10% de FBS pendant 7 passages, 96.4% des cellules expriment l’α-smooth muscle-actine (α-sm-actine), tandis que 83.8% et 77% expriment la desmine et la myosine respectivement. Les cellules musculaires lisses issues de biopsies endobronchiques expriment après 7 passages à 84% l’α-sm-actine, à 57% la desmine et 69% la myosine. Ces résultats ont été obtenus par immunofluorescence et immunobuvardage. Le pourcentage de cellules exprimant les protéines d’intérêt, tout comme l’intensité moyenne de fluorescence ne présentent pas de variation significative ni entre le 4ième et le 7ième passage, ni avec la caractérisation initiale, lors du premier passage.

Cette étude suggère qu’il est possible de maintenir le phénotype contractile en culture sur plastique en présence de 10% de FBS, et que les biopsies endobronchiques sont un support d’étude valable pour de futures investigations concernant le rôle du muscle lisse et ses caractéristiques.

Endobronchial smooth muscle is one of the main stakeholder in asthma by alteration of his volume and phenotype. Sampling airway smooth muscle using endobronchial biopsies is performed in order to study pathways associated with remodeling, but currently, little is known regarding the stability of the ASM phenotypes during in vitro culture. Specifically, whether the contractile phenotype is maintained in culture and his evolution across passages is not established. Two problems could explain this lack of information: first the sampling, secondly the maintenance of contractile phenotype in culture.

We developed culture condition based on tracheal smooth muscle in the aim to ensure the upkeep of contractile phenotype. Then we developed a sampling protocol to harvest and maintain in culture ASM cells from endobronchial biopsies on a live animals. The stability of the ASM contractile phenotype was evaluated at each passage using immunofluorescence, FACS and western blot for α-sm-actin, desmin and myosin contents over a 2-month period. No significant differences were observed between the first and the fourth last passage (4th to 7th). 96.4% of the tracheal smooth muscle cell expressed α-sm-actin, 83.3 and 77% of cells expressed desmin and myosin respectively, at the 7th passage. Endobronchial smooth muscle expressed 84% of α-sm-actin, 57% of desmin and 69% of myosin, respectively.

Contractile phenotype was maintained and we determined evolution of contractile phenotype in standardize conditions that will provide a characterized support for coming research.