Utilisation d’un modèle de co-culture cellulaire pour l’évaluation in vitro du transport inverse du cholestérol

Abstract

De nouveaux modèles cellulaires in vitro par transfert de milieu et par coculture ont été mis au point afin d’évaluer la capacité des HDL à éliminer l’excès de cholestérol des tissus périphériques et de le transporter vers le foie afin d’être excrété par le foie, un processus nommé le transport inverse du cholestérol (TIC). Le système cellulaire par transfert in vitro où des macrophages J774 sont gorgés de LDL acétylées et marqués au 3H-cholestérol a été préalablement établi afin de mesurer par scintillation l’efflux de cholestérol marqué vers le milieu de culture contenant des accepteurs de cholestérol. Ce milieu conditionné est transféré sur des cellules HepG2 afin d’étudier l’influx du cholestérol marqué. Ce dernier nous permet d’observer un transport de cholestérol de 25 % hors des J774 et un transport de 39 000 cpm dans les HepG2 en utilisant un milieu contenant 2 % de sérums humains mis en commun. Une stimulation des cellules J774 par l’AMPc augmente l’efflux et l’influx d’environ 45 %. Des tests de preuve de concept ont été effectués sur le système cellulaire par co-culture qui utilise des chambres de Boyden où les J774 sont localisées au fond d’un puits et les HepG2 dans un insert, et où le milieu est partagé entre les deux types cellulaires. On a déterminé qu’une confluence densité de 60 000 cellules/cm2 sur un insert constitué d’une membrane de polyester avec des pores de 3,0 μm, sans autre revêtement, permet d’observer un influx spécifique au sérum d’environ 6 000 cpm associés aux cellules HepG2, où 50 % des comptes radioactifs sont dans les cellules et l’autre moitié présente à la surface cellulaire.

To assess the ability of HDL particles to remove excess cholesterol from peripheral tissues and to transport it toward the liver for biliary excretion, a process known as reverse cholesterol transport (RCT), new in vitro models, one by transfer and the other by co-culture were developed. An in vitro system by transfer with acetylated LDL loaded lipid-laden-foam cells, J774 cells, labeled with 3H-cholesterol was first established to measure scintillation labelled cholesterol efflux to the culture medium containing cholesterol acceptors. This conditioned medium is transferred to HepG2 cells to study the influx of labeled cholesterol. This allows us to observe a cholesterol transport of 25 % out of J774 cells and an uptake of 39 000 cpm in HepG2 using a medium containing 2 % pooled human serum. Stimulation of J774 cells by cAMP increased cholesterol efflux from J774 and cholesterol influx in HepG2 cells by 45 %. Set up tests were conducted to develop an in vitro co-culture system, using transwells permeable supports, where J774 cells were harvested in wells and HepG2 cells in inserts, and where both share the same medium. It was determined that a cell confluency of 60 000 cells/cm2 in an insert having a polyester membrane with pores of 3.0 μm, without coating allows to notice a serum specific influx around 6 000 cpm associated to HepG2, where 50 % of those cpm are in the cell and the other half, present at the HepG2 cell surface.