Purification par affinité et marquage isotopique spécifique pour études d’ARN fonctionnels

Abstract

Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements. Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par spectroscopie RMN.

The tridimensional structure of a given RNA molecule is closely linked to its cellular function. For this reason, it is crucial to study the structure of RNA molecules, such as riboswitches, to characterize their mechanism of action. To do so, NMR spectroscopy is often used to gather structural data on RNA molecules in solution. However, this approach is limited by two main difficulties. First, the production of preparative quantities of natively folded and purified RNA molecules is a long and tedious process. To facilitate this step, our laboratory has developed an RNA-affinity purification method using an ARiBo tag. The second limiting step comes from the extensive signal overlap detected on NMR spectra of large RNA molecules. This overlap is proportional to the length of the RNA, which often prevents high-resolution structure determination of RNAs larger than 15 kDa. To solve this problem, specific isotopic labeling of RNAs can now be achieved. However, existing labeling protocols are expensive, require several weeks of laboratory manipulations and usually provide relatively low yields. This thesis provides an alternative strategy to achieve specific isotopic labeling of RNA molecules, based on the ARiBo tag affinity purification technique. The protocol includes the separation and the purification of isotopically labeled nucleotides, an enzymatic ligation step performed on a solid support and the affinity purification of the RNA of interest, without any sequence restriction. This new strategy is a fast and efficient way to label functional RNAs isotopically and should facilitate NMR structure determination of large RNAs.